南方红豆杉水提物通过Ras/MAPK信号通路调控HER2阳性胃癌移植瘤生长实验研究

戴飞飞 谢长生

南方红豆杉水提物通过Ras/MAPK信号通路调控HER2阳性胃癌移植瘤生长实验研究

戴飞飞1谢长生2

目的探讨南方红豆杉水提物通过抑制Ras/MAPK信号通路相关靶点蛋白表达，调控裸鼠HER2阳性胃癌移植瘤生长及其机制。方法建立荷瘤裸鼠模型，将80只BALB/c裸鼠接种人表皮生长因子-2（HER2）阳性胃癌NCI-N87细胞株，并随机分组给药及取瘤，采用Western Blot检测HER2、KRAS蛋白表达，RT-PCR定量检测HER2、KRAS mRNA表达水平。结果①Western blot检测HER2、KRAS蛋白：与空白组比较，各给药组HER2、KRAS蛋白表达不同程度下调[HER2：（1.238±0.123、1.180±0.152、1.159±0.087、0.876±0.098、0.651±0.108、0.554±0.110）比（1.482±0.101），P＜0.05或P＜0.01；KRAS：（0.768±0.040、0.680±0.019、0.821±0.170、0.716±0.023、0.630±0.049、0.739± 0.044）比（1.015±0.033），P均＜0.05]；与赫赛汀组比较，中剂量联合组KRAS蛋白表达显著下调（0.630±0.049比0.759±0.029，P＜0.05）；②RT-PCR检测HER2、KRAS mRNA表达：与空白组比较，各给药组HER2、KRAS mRNA表达不同程度下调[HER2 mRNA：（0.916±0.026、0.783±0.061、0.846± 0.021、0.741±0.079、0.660±0.079、0.673±0.045）比（1.000±0.193），P均＜0.05；KRAS mRNA：（0.643± 0.065、0.551±0.173、0.572±0.267、0.329±0.250、0.036±0.007、0.351±0.257）比（1.001±0.132），P＜0.05或P＜0.01]；与赫赛汀组比较，中剂量联合组KRAS mRNA表达显著下调（0.036±0.007比0.362± 0.162，P＜0.01）。结论南方红豆杉水提物可通过Ras/MAPK信号通路部分下调HER2、KRAS蛋白及其mRNA表达水平，联合赫赛汀可增强其抑制作用。

裸鼠；胃癌；Ras/MAPK；南方红豆杉；曲妥珠单抗；表皮生长因子受体

胃癌的发生发展是一个多靶点、多环节的信号传导通路错综复杂的过程。实验研究发现，曲妥珠单抗（trastuzumab，herceptin，TM）主要通过拮抗人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）信号传达通路而发挥抑制肿瘤细胞的生长，且激活肿瘤细胞凋亡信号或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性导致肿瘤细胞的凋亡[1-3]。Ras/MAPK信号通路是HER2下游重要信号通路之一，其通过影响细胞内基因的表达、转录及调控继而影响细胞生长、代谢等生物学行为，引起肿瘤的产生及恶变[4]。药理研究显示，红豆杉中的40多种有效成分具有抑制肿瘤细胞增殖及血管增生、抗肿瘤浸润及转移的作用[5]。本实验通过建立荷瘤裸鼠模型，观察不同剂量南方红豆杉及曲妥珠单抗单药或联合给药对Ras/MAPK信号通路相关靶点的作用，并从蛋白及mRNA表达水平探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物BALB/c裸鼠80只，4～6周龄，体质量18～20g。上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，实验生物合格证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 试剂及仪器Hylcone胎牛血清（美国Thermo公司），RPMI-1640培养液（吉诺生物医药技术有限公司），HER2抗体、KRAS抗体（美国Cell Signaling公司），辣根过氧化物酶标记的抗鼠、抗兔二抗（美国Santa Cruz公司），Marker（加拿大Fermentes公司）。蛋白印迹检测系统（美国Bio-Rad公司），定量PCR仪器（美国ABI公司），Nikon eclipse 80i显微镜（Nikon公司）。

1.3 药物及其制备南方红豆杉（规格8g/包，由宁波泰康红豆杉生物工程有限公司生产，生产批号100513）。南方红豆杉水提物的制备[6]：8g南方红豆杉浸泡过夜，加7倍水煮沸20min后倒出药液，再加5倍水煮20min，再将两次药液混匀经旋转蒸发仪，蒸发浓缩至208mg/mL，静置过夜后用过滤网清除药渣，将剩余药液作为高剂量母液，再按1：2和1：4体积纯水稀释出中剂量提取液104mg（生药量）/mL，低剂量提取液52mg（生药量）/mL，于4℃冰箱保存备用。曲妥珠单抗（商品名：赫赛汀，Herceptin，规格440mg/瓶，上海罗氏制药有限公司，批号N3586），赫赛汀溶液配制：用20mL灭菌注射用水配制成无色至淡黄色透明液体作为母液，浓度21mg/mL，4℃冰箱保存备用。

1.4 细胞培养人胃癌细胞株NCI-N87，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用10%胎牛血清及RPMI-1640培养液，在5%CO2，37℃条件下培养，细胞贴壁生长后取对数生长期细胞。

2 实验方法

2.1 动物模型建立及分组给药第1天取对数生长期的人胃癌NCI-N87细胞株接种于每只裸鼠右侧腋窝下，待第7天观察瘤体情况并将80只BALB/c裸鼠随机分为空白组、红豆杉高剂量组、红豆杉中剂量组、红豆杉低剂量组、Herceptin联合红豆杉（高、中、低）剂量组，赫赛汀（Herceptin）单药组，共8组，每组10只。同时开始给药灌胃，每次3mL中药浓缩液，空白组给予与南方红豆杉同等体积的生理盐水灌胃，共给药3周。接种后第28天取瘤用于瘤组织蛋白提取检测蛋白表达及免疫组化检测。

2.2 Western Blot检测蛋白表达取适量瘤组织加入RIPA裂解液（含PMSF），进行匀浆再置于冰上，并重复3次。裂解30min后进行4℃下12 000r/min离心5min。取上清液放入-20℃水箱保存；用BCA法进行蛋白浓度测定，计算待测蛋白样品浓度；然后进行SDS-PAGE电泳；最后用quantity one软件测定各条带的灰度值（A），各组的A值与相应的β-actin的A值的比值代表蛋白的相对表达量。

2.3 实时定量PCR检测基因表达取出适量保存在液氮中的移植瘤组织约50mg放入2mLEP管中进行组织总RNA提取和纯化（RNeasy Mini Kit），再吸取1μL抽提的RNA在Nan odropl000上进行RNA浓度测定，若OD260/ OD280为1.8～2.0，表明RNA样品可以使用。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外光观察28s、18s、5s三条条带，以确定RNA的完整性。然后RNA逆转录成cDNA，最后进行PCR扩增（引物合成主要由上海生工设计）。见表1。

表1 RT-PCR各对应引物序列

按照Power SYBR Green PCR试剂盒说明进行操作，以cDNA为模板，GAPDH为内参来检测标本中各基因的表达水平。反应体系：10μmol/ L primer（上下游）0.5μL，SYBR 2.5μL，灭菌双蒸水1μL，cDNA 1μL；扩增条件为：预变性95℃、5min预变性，94℃、1min，退火1min，72℃、1min延伸，进行32个循环后，72℃8min终末延伸。用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值分析目的基因的相对表达水平。

2.4 统计学方法应用SPSS22.0统计进行分析处理，数据以均数±标准差（x±s） 表示，计量资料的多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 Western Blot检测各组瘤组织HER2、KRAS蛋白表达用quantity one软件分析并与βactin灰度值比值显示结果，与空白组比较，各给药组HER2、KRAS蛋白表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）；与赫赛汀组比较，各给药组的HER2蛋白表达不同程度上调（P＜0.05或P＜0.01）；中剂量红豆杉组及联合组KRAS蛋白表达显著下调（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 各组小鼠瘤组织HER2、KRAS蛋白表达量比较（x±s）

图1 各组小鼠瘤组织HER 2、KRAS蛋白表达

3.2 RT-PCR检测各组瘤组织HER2、KRAS mRNA表达与空白对照组比较，各给药组HER2、KRAS mRNA表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）；与赫赛汀组比，各给药组可不同程度上调HER2 mRNA表达（P＜0.05或P＜0.01），中剂量联合组显著下调KRAS mRNA表达（P＜0.01）。见表3，图2～3。

4 讨论

南方红豆杉Taxus chinensis var.Mairei为红豆杉属的常绿针叶植物，其又被称作“紫杉”。药理研究[7]显示，红豆杉提取物可促进白介素1、2，肿瘤坏死因子，干扰素等细胞因子的合成；激活巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞，调节抗体和补体而明显提高免疫功能。

实验研究[8]发现，曲妥珠单抗对HER2高表达的NCI-N87胃癌细胞具有抗体依赖的细胞介导的毒性作用并且可显著增强抗肿瘤活性。HER2是具有受体酪氨酸激酶（RTK）活性的原癌基因，是细胞增殖、胚胎发育、组织分化的重要介质[9]。膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传导（Ras/ MAPK）途径是广泛存在于细胞中的一条关键性调控细胞生存与凋亡的传导通路。其主要作用机制：在细胞外信号诱导下，HER2/neu与其他EGF受体形成二聚体，激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），使其由胞质转位到核内，最终影响核内转录因子，调节基因转录及表达[10]。KRAS是Ras家族成员之一，研究表明，胃癌组织KRAS蛋白表达率高于癌旁组织，且与肿瘤组织的浸润、肿瘤分期及淋巴结转移相关，提示KRAS蛋白过表达在胃癌转移进展中发挥重要作用[11-12]。

本实验研究显示，与空白对照组比较，各用药组HER2蛋白表达下调，提示红豆杉水提物及赫赛汀通过降低HER2蛋白在胃癌细胞表面的表达，继而抑制HER2蛋白与其他受体酪氨酸激酶形成异源二聚体，干扰自身磷酸化从而阻断下游信号传导通路的持续激活。另外，实验结果还显示，与空白组比较，各给药组KRAS表达可不同程度下调，显示南方红豆杉水提物及曲妥珠单抗通过使Sos无法激活Ras功能性活化蛋白表皮生长因子受体HER2的活性，从而抑制KRAS活化，继而无法激活其下游相关效应因子来阻断下游信号传导通路最终抑制细胞生长，诱导凋亡。

实验研究发现，南方红豆杉水提物作用于人HER2阳性人NCI-N87胃癌细胞荷瘤裸鼠移植瘤后，总体上HER2、KRAS蛋白表达较空白组可有不同程度下调。表明经南方红豆杉水提物干预，可下调HER2、KRAS蛋白（EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK）传导通路上的表达，使信号通路受阻而抑制HER2阳性人NCI-N87胃癌细胞增殖。本实验中Western blot与RT-PCR检测结果基本一致，但两种检测方法显示南方红豆杉水提物作用于HER2、KRAS蛋白的最有效浓度存在一定的差异性，这可能与不同剂量药物对Ras/MAPK信号通路上不同位点调控的程度不同相关。

综上所述，本实验结果表明，南方红豆杉水提物可部分下调HER2、KRAS蛋白及其mRNA及表达水平，联合赫赛汀可增强其抑制作用。

表3 各组小鼠瘤组织HER2、KRAS蛋白表达量比较（x±s）

图2 HER 2范围扩增溶解曲线

图3 HRAS范围扩增溶解曲线

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（收稿：2016-07-13修回：2016-08-05）

Taxus Chinensis Water Extract Inhibited the Growth of HER2-positive Gastric Cancer through Regulating Ras/MAPK Signaling Pathway

DAI Feifei1,XIE Changsheng2.1 ICU,Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of taxus chinensis water extract on human epidermal growth receptor 2（HER2）-positive gastric cancer via regulating Ras/MAPK pathway related proteins.M ethods Nude mouse model bearing HER2-positive gastric cancer was established by inoculating NCI-N87 tumor strain.Eighty BALB/c mice were randomized into high-,middle-,low-dose taxus chinensis groups,high-,middle-,low-dose taxus chinensis+herceptin groups,and herceptin group and given the corresponding drugs.Mice were killed by cervical dislocation to obtain tumor tissue for inspection.The protein expression of HER2 and KRAS were detected with Western Blot and mRNA contents of the genes were determined by RT-PCR assay.Results Compared with blank group,the expression of HER2 and KRAS proteins were decreased in all drug groups（HER2：1.238±0.123,1.180± 0.152,1.159±0.087,0.876±0.098,0.651±0.108,0.554±0.110 vs 1.482±0.101,P＜0.05 or P＜0.01;KRAS：0.768± 0.040,0.680±0.019,0.821±0.170,0.716±0.023,0.630±0.049,0.739±0.044 vs 1.015±0.033,all P＜0.05）.Compared with that in herceptin group,KRAS protein in middle-dose taxus chinensis+herceptin group was significantly decreased（0.630±0.049 vs 0.759±0.029,P＜0.05）.Compared with blank group,the expression of HER2 and KRASmRNA were decreased in all drug groups（HER2 mRNA：0.916±0.026,0.783±0.061,0.846±0.021,0.741±0.079, 0.660±0.079,0.673±0.045 vs 1.000±0.193,all P＜0.05；KRAS mRNA：0.643±0.065,0.551±0.173,0.572±0.267, 0.329±0.250,0.036±0.007,0.351±0.257 vs 1.001±0.132,P＜0.05or P＜0.01）.Compared with that in herceptin group, KRAS mRNA in middle-dose taxus chinensis+herceptin group was significantly decreased（0.036±0.007 vs 0.362± 0.162,P＜0.01）.Conclusion Taxus chinensis water extract can down regulate the expression of HER2,KRAS protein and mRNA via Ras/MAPK pathway in mice with gastric cancer.When it is combined with herceptin,its anti-tumor effect is enhanced.

nude mice;gastric cancer;Ras/MAPK;Taxus chinensis water extract;trastuzumab;epidermal growth receptor

浙江省自然科学基金（No.LY13H290013）；浙江省中医药科技计划项目（No.2013ZA043）

1浙江中医药大学附属第二医院ICU（杭州310005）；2浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科（杭州310006）

谢长生，Tel：0571-87071083