采后亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制及贮藏品质的影响

高春丽，李永才*，毕 阳，刘 筱，杨 兰，乔文景，王 迪，唐 瑛（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）



采后亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制及贮藏品质的影响

高春丽，李永才*，毕 阳，刘 筱，杨 兰，乔文景，王 迪，唐 瑛
（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

通过离体和体内实验研究亚硒酸钠对杏果黑斑病菌互隔交链孢（Alternaria alternata）的抑制作用及黑斑病的控制效果和贮藏品质的影响。结果表明，亚硒酸钠处理能显著抑制A.alternata菌落的生长和孢子萌发，且存在质量浓度效应，40 mg/L的亚硒酸钠能显著抑制A.alternata菌落的生长，其菌落直径较对照降低了30.8%，同时亚硒酸钠还能使A.alternata菌丝发生凹陷、扭曲等形态结构的改变；体内实验表明，采后亚硒酸钠处理能有效抑制损伤接种A.alternata的杏果黑斑病的扩展，其中20 mg/L亚硒酸钠的控制效果最佳，其病斑直径较对照减小了11%；采后亚硒酸钠处理还能够明显减少杏果乙烯的释放和呼吸强度的升高，延缓质量损失率和硬度的降低。可见硒在果蔬采后防腐保鲜中具有潜在的应用前景。

亚硒酸钠；杏果；黑斑病；抑菌特性；贮藏品质

杏果（Armeniaca vulgaris）色泽鲜艳、芳香浓郁、甜酸适口、营养丰富，深受人们的喜爱［1］。但杏果采后易受机械损伤、贮藏期短，尤其易受根霉、互隔交链孢等病原菌侵染而发病，其中以互隔交链孢（Alternariaalternata）引起的黑斑病尤为严重，造成了巨大的经济损失。且A.alternata是果蔬采后的常见病原物，可引起苹果梨、甜椒、柑橘、杏等多种果蔬产生黑斑［2］。虽然可通过使用人工合成杀菌剂进行病害控制，但由于人工合成杀菌剂长期使用会造成环境污染、病原菌抗病性和农药残留问题。因此，开发杏果采后安全的防腐剂已势在必行。

1973年，世界卫生组织和国际营养组织确认硒为人和动物体内必需的微量元素，主要是通过蛋白质特别是与酶蛋白结合发挥抗氧化作用。硒是谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶的组分［3］，适量的硒在一定程度能提高植物体的抗氧化作用［4-5］，在人体调节免疫、抵制病毒突变、防治癌症的发生等方面也起着十分重要的作用［6-7］。近期调查发现在某些含硒量高的地区癌症发病率较低，因此各种富含硒的食品受到广泛的青睐。但高浓度硒会对植物产生毒害作用［8-10］；对部分生物体来说，硒缺乏、必需和毒害剂量间的差异非常小［11-13］。很多研究证实低浓度亚硒酸盐对植物生长有促进作用，而高浓度则抑制其生长［14］。王文举等［15］研究表明，喷施亚硒酸钠溶液的葡萄植株能够提高葡萄果实的耐热性，改善成熟葡萄果实的品质。刘树梅等［16］研究表明，叶面喷施适宜量的亚硒酸钠能明显提高果实可溶性固形物（total soluble solid，TSS）和含硒量，且杏树的适宜使用量为30 mg/kg时，果实TSS含量达11.3%，果实含硒量为13.0 μg/kg。近期研究还发现亚硒酸钠能够显著抑制Penicillum expansum孢子萌发、芽管伸长及菌丝生长，且抑制效果与硒的浓度呈正相关［17］，表明硒可能作为一个潜在的替代合成杀真菌剂控制苹果采后青霉病。但有关硒对采后病原物抑制的广谱性及其机理的系统研究鲜见报道。

本研究以兰州大接杏为材料，研究亚硒酸钠对杏果黑斑病菌A.alternata的抑制作用及亚硒酸钠处理对杏果采后生理及贮藏品质的影响，以期为硒在采后果蔬防腐保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株与试剂

供试兰州大接杏于2015年7月购于兰州市安宁区桃海市场，剔除病果伤果，选择大小、果色均匀且成熟度一致的果实，纸箱包装后当天运抵实验室进行处理。

供试菌株为A.alternata，分离于自然发病果实，纯化后马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上保存待用。

亚硒酸钠（分析纯） 上海中秦化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DHP-9272B型恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；WYT-32型手持折光仪 厦门中村光学仪器厂；GXH-3051H型果蔬呼吸仪 北京均方理化科技研究所；S3400N型扫描电子显微镜 日本日立高新技术有限公司；7820A型气相色谱仪 美国Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基制作

参照方中达［18］方法进行。PDA培养基配方为：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。将200 g马铃薯削皮后切成1 cm3体积的小块，加水煮沸30 min后4 层纱布过滤并定容至1 000 mL，然后将一定量琼脂和蔗糖分别与马铃薯过滤液混合，分装在三角瓶中进行高压灭菌，制备PDA平板。

1.3.2 病原菌分离、纯化与鉴定

参照李永才［19］的方法进行。采集黑斑病病果，用75%酒精表面消毒，再用无菌水冲洗后切取病健交界组织，在无菌操作条件下移至PDA培养基上，于28 ℃保温培养，待长出分生孢子之后进行分离、纯化，分离纯化后的菌种要经过侵染回接实验才能认定其致病性。将各分离纯化后的菌株回接到杏果上，如果发病症状与贮藏时出现的病症相符合，方可作为采后病害病原菌进一步鉴定到属种，鉴定后在PDA培养基上保存备用。

1.3.3 孢子悬浮液的配制

参照刘红霞等［20］的方法并修改，在进行分离、纯化、鉴定后培养7 d的A.alternata中各倒入少量无菌水，加入少量0.01% Tween-80，用灭过菌的涂布棒轻刮，并通过4 层纱布过滤到三角瓶中，用无菌水稀释，在混合器上振荡15 s，用血球计数板计数，配制成106CFU/mL孢子悬浮液。

1.3.4 亚硒酸钠对A.alternata菌落生长的影响

参照范青等［21］的方法进行并作修改。分别取15 mL含有0、5、10、20、40 mg/L亚硒酸钠的PDA培养基（以每1 L计），将其均匀平铺在直径为9 cm的培养皿中，以不加药物的PDA为对照，待平板冷却后分别将纯化的A.alternata菌饼（直径8 mm）接于培养皿中央，28 ℃避光培养。当对照培养皿中的菌斑长满培养皿时，测定各处理菌落直径。上述实验重复3 次。并参照吴慧昊等［22］方法计算其抑菌率。

1.3.5 亚硒酸钠对A.alternata孢子萌发的影响

打孔器采用酒精灯火焰法灭菌后，打孔取水琼脂饼（2%的琼脂溶液灭菌后倒入9 cm的培养皿中，待冷却），置于无菌载玻片上，向水琼脂饼上滴加10 µL质量浓度分别为0、5、10、20、40 mg/L的亚硒酸钠溶液，再在其上加10 µL 1×106个/mL振荡均匀的A.alternata孢子悬浮液，于25 ℃在光学显微镜下连续数镜检孢子萌发率，直至对照组完全萌发（芽管长度大于或等于孢子最短径的一半时认为其萌发），每个处理3 次重复。

1.3.6 亚硒酸钠对A.alternata菌落形态的影响

参照高向阳等［23］的方法。将含有20 mg/L亚硒酸钠的培养基上生长7 d的菌丝块（0.5 cm×0.5 cm）及对照菌丝块用体积分数2%戊二醛溶液固定，于4 ℃放置2 h；经乙醇系列梯度（50%、70%、95%、100%）处理10 min，醋酸异戊酯置换乙醇20 min。脱水样品进行临界点干燥，真空喷金。在扫描电子显微镜下观察制好的样品并拍照。

1.3.7 亚硒酸钠对损伤接种杏果黑斑病的抑制

参照Moscoso-Ramírez等［24-25］的方法。选择大小、果色均匀一致、无伤病的果实用2%次氯酸钠溶液浸泡2 min，清水冲洗，晾干，用70%酒精进行果实表面消毒，然后用灭菌铁钉（直径3 mm）在果实赤道部位均匀刺孔2 个，每孔中注入1×106个/mL A.alternata孢子悬浮液10 μL，接种2 h后在刺孔中各接入等质量浓度分别为0、5、10、20、40 mg/L亚硒酸钠溶液。晾干后用市售聚乙烯保鲜袋（25 mm×40 mm，厚度0.02 mm）包装，在30 ℃条件下贮藏，7 d后用十字交叉法测定病斑直径，每处理用果10 个。

1.3.8 生理指标的测定

选择大小、果色均匀一致、无伤病、未经处理的果实用2%次氯酸钠溶液浸泡2 min，清水冲洗后，分别在0、5、10、20、40 mg/L亚硒酸钠溶液浸泡5 min，以蒸馏水浸泡处理作对照，取出后在室温条件下晾干，市售聚乙烯保鲜袋（25 mm×40 mm，厚度0.02 mm）包装，30 ℃条件下贮藏。每处理用果6 个，3 次重复。

1.3.8.1 质量损失率的测定

采用称量法。每个处理用果实6 个，重复3 次。

1.3.8.2 呼吸强度的测定

参照寇晓红等［26］方法，采用果蔬呼吸仪进行测定。气体流速500 mL/min。各处理用果实6 个，重复3 次，取平均值。

1.3.8.3 果实乙烯释放量的测定

取0.5 kg果实放入2 L干燥器中密封4 h，抽取1 mL混合气体注入气相色谱仪测定乙烯释放量。乙烯释放量分析条件：DM-5色谱柱，汽化室温度1200 ℃，柱温60 ℃，氢气压力0.7 kg/cm2，空气压力0.7 kg/cm2，氮气压力1.0 kg/cm2，氢火焰离子化检测器检测，检测室温度150 ℃，单位为μL/（kg·h）。

1.3.9 品质指标的测定

1.3.9.1 TSS含量的测定

采用手持折光仪进行测定。果实最大直径处均匀选3 个点测定，每个处理用果实6 个，重复3 次。

1.3.9.2 硬度的测定

果实硬度使用果蔬硬度计测定。果实最大直径处去皮后均匀选3 个点测定，每个处理用果实6 个，每处理重复3 次。

1.4 数据处理

所有实验数据采用Microsoft Excel 2010计算标准偏差并作图，并用DPS 7.05数据处理系统进行Duncan's多重差异显著分析。图中竖线代表标准误，相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。

2 结果与分析

2.1.1 亚硒酸钠处理对A.alternata菌丝生长的影响

图1 亚硒酸钠处理对 A.a lter nata 菌丝生长的影响Fig.1 Effect of sodium selenite treatment on mycelial growth of A.alternata

由图1可知，亚硒酸钠能显著地抑制A.alternata的菌丝生长（P＜0.05），且随着处理质量浓度的增加，抑菌作用越明显。其中40 mg/L的亚硒酸钠抑菌效果最好，培养7 d后其菌落直径仅为5.55 cm，较对照降低了30.8%，抑菌率达到了52%。

2.1.2 亚硒酸钠处理对A.alternata孢子萌发的影响

图2 亚硒酸钠处理对 A.a lter nata 孢 子萌发的影响Fig.2 Effect of sodium selenite treatment on spore germination of A.alternata

由图2可知，A.alternata孢子萌发率均随培养时间的延长逐渐增大，在2 h时，高质量浓度亚硒酸钠处理刺激了孢子的萌发，但随时间的延长则呈现抑制作用。6 h时对照组孢子萌发率已高达95.33%，而20 mg/L的亚硒酸钠处理组为85.7%，较对照组降低了10.1%。

2.1.3 亚硒酸钠处理对A.alternata菌丝形态的影响

图3 亚硒酸钠处理对 A.alterna ta 菌丝形态的影响Fig.3 Effect of sodium selenite treatment on mycelial morpholgy of A.alternata

通过扫描电子显微镜图片发现，与对照（图3A）相比亚硒酸钠处理后菌丝折叠扭曲盘绕（图3B），进一步观察发现，亚硒酸钠处理菌丝明显脱水扭曲，且孢子也皱缩、塌陷（图3D），而对照A.alternata孢子较为饱满，菌丝均匀一致（图3C）。

2.1.4 亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制

图4 亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制Fig.4 Controlling effect of sodium selenite treatment on apricot fruit black spot

由图4可知，亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的扩展具有一定的控制效果，随质量浓度的增加呈现先下降后骤然升高的现象。其中20 mg/L的抑菌效果最显著，病斑直径比对照减小了11%，而40 mg/L的亚硒酸钠处理病斑直径反而增大，这可能是高质量浓度亚硒酸钠处理对杏果造成了药害。

2.2 亚硒酸钠处理对杏果贮藏品质及生理特性的影响

2.2.1 对呼吸强度和乙烯释放量的影响

乙烯释放量呈先上升后下降的趋势，总体上亚硒酸钠处理能有效减少杏果乙烯的释放量（图5A）。当贮藏到第6天时乙烯释放量达到了最大值，其中20 mg/L的亚硒酸钠处理能够明显减少乙烯的释放，较对照组降低了18.6%。

图5 亚硒酸钠处理对杏果乙烯释放量（A）和呼吸强度（B）的影响Fig.5 Effect of sodium selenite treatment on ethylene release （A） and respiration intensity （B） in apricot fruit

由图5B可知，贮藏期间杏果呼吸强度呈先上升后下降的趋势，处理组呼吸强度均低于对照。贮藏8 d时达到了呼吸高峰，此时对照组呼吸强度高达38.97 mg CO2/（kg·h），而20 mg/L的亚硒酸钠处理组仅为为26.01 mg CO2/（kg·h），较对照降低了33.26%，但亚硒酸钠处理对于呼吸高峰的出现时间没有影响（图5B）。

2.2.2 对杏果质量损失率的影响

图6 亚硒酸钠处理对杏果质量损失率的影响Fig.6 Effect of sodium selenite treatment on weight loss of apricot fruit

由图6可知，果实质量损失率随贮藏时间的延长逐渐增大，处理后的果实质量损失率低于对照，但当亚硒酸钠的质量浓度为40 mg/L时，却显著高于对照。贮藏到第8天亚硒酸钠质量浓度为20 mg/L时，杏果实的质量损失率最小，较对照降低了34.9%。

2.2.3 对TSS含量和硬度的影响

由图7A可知，杏果TSS含量随贮藏时间的延长总体呈现出先上升后下降的趋势，亚硒酸钠处理增加了杏果TSS含量，贮藏到第8天时对照与20 mg/L亚硒酸钠溶液处理后果实的TSS含量分别为7.28%、7.63%。

图7 亚硒酸钠处理对杏果TSS含量（A）和硬度（B）的影响Fig.7 Effect of sodium selenite treatment on total soluble solids content （A） and firmness （B） in apricot fruit

由图7可知，果实硬度在贮藏期间迅速下降，且40 mg/L亚硒酸钠处理在贮藏后期明显地延缓了果实硬度的降低，其硬度比对照高10%。

3 讨论与结论

硒作为人体重要的微量元素具有提高人体免疫力、抗氧化抗衰老、参与糖尿病的治疗、防癌抗癌、保护眼睛、保护修复细胞、防治心血管类疾病等多种功效。本实验发现20 mg/L的亚硒酸钠处理能显著抑制A.alternata孢子萌发及菌落生长，这与Wu Zhilin等［17］在P.expansum上的研究一致，其结果表明硒还具有抑菌特性，同时还发现硒处理不仅能够显著降低P.expansum孢子细胞膜的完整性，而且诱导胞内活性氧（H2O2、O2-）产生、降低超氧化物歧化酶的活性，可见硒可能是通过影响病原物细胞膜及胞内活性氧代谢系统而抑制病原物的生长，但其具体的作用机理尚需进一步研究。

微量的硒是许多生物体必需的一种微量营养素，包括人类和其他动植物［27］。低浓度的硒能增强植物的抗菌及抗氧化特性［14］。本实验研究发现硒处理不仅能抑制杏果黑斑病的扩展，而且能够明显减少杏果乙烯的释放和呼吸强度的升高、延缓质量损失率和硬度的降低，可见硒在果蔬采后防腐保鲜中具有潜在应用前景，但有关其作用机理及采后规范化的处理技术尚需进一步研究。

综合以上，亚硒酸钠处理能显著地抑制A.alternata菌落生长和孢子萌发，同时还能使A.alternata菌丝发生凹陷、扭曲等形态结构的改变。采后亚硒酸钠处理能够有效地抑制杏果黑斑病的扩展，20 mg/L亚硒酸钠抑制效果最显著，病斑直径较对照减小了11%。亚硒酸钠处理能够抑制杏果乙烯的释放量和呼吸强度的升高、延缓质量损失率和硬度的降低，有效地保持杏果的贮藏品质。

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Effects of Sodium Selenite Treatment on Black Spot Disease and Storage Quality of Postharvest Apricot Fruit

GAO Chunli， LI Yongcai*， BI Yang， LIU Xiao， YANG Lan， QIAO Wenjing， WANG Di， TANG Ying
（College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Effects of sodium selenite on the in vitro and in vivo growth of Alternaria alternata， the causal agent of black rot disease in vitro， disease development and storage quality of apricot fruit were investigated.The results showed that mycelial growth and spore germination of A.alternata were significantly （P ＜ 0.05） inhibited by sodium selenite treatment，and the optimal inhibitory effect was achieved at a concentration of 40 mg/L.Additionally， sodium selenite treatment caused changes in the morphological structure of A.alternata mycelia such as sunken and distorted hyphae as observed by scanning electron microscopy （SEM）， with a 30.8% reduction observed in its colony diameter as compared to the control.In vivo experiments showed that the lesion expansion of apricot fruit inoculated with A.alternata was effectively inhibited by treatment with 20 mg/L sodium selenite.In addition， the ethylene release and respiration intensity of apricot fruit were significantly reduced while the reductions of weight loss and firmness were delayed.These findings suggested that selenium has potential application in disease control and preservation of postharvest fruits and vegetables.

sodium selenite； apricot fruit； black rot； antifungal activity； storage quality

10.7506/spkx1002-6630-201614047

TS201.3

A

1002-6630（2016）14-0258-06

高春丽， 李永才， 毕阳， 等.采后亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制及贮藏品质的影响［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 258-263.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614047. http://www.spkx.net.cn

GAO Chunli， LI Yongcai， BI Yang， et al.Effects of sodium selenite treatment on black spot disease and storage quality of postharvest apricot fruit［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 258-263.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614047. http://www.spkx.net.cn

2015-11-17

甘肃农业大学青年导师基金项目（GAU-QNDS-201208）

高春丽（1990—），女，硕士研究生，研究方向为采后果蔬贮藏与保鲜。E-mail：gaochunli1214@sina.com

*通信作者：李永才（1972—），男，副教授，博士，研究方向为采后果蔬贮藏病害控制。E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn