枣核木醋液化学成分分析及其抑菌活性

张立华，王 丹，宫文哲，唐婷婷（.枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 7760；.枣庄市环保局，山东 枣庄 77800）



枣核木醋液化学成分分析及其抑菌活性

张立华1，王 丹1，宫文哲2，唐婷婷1
（1.枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160；2.枣庄市环保局，山东 枣庄 277800）

为了充分利用枣核资源，采用干馏法（150～400 ℃）制得枣核木醋液，并采用气相色谱-质谱联用仪分析其化学成分，通过对大肠杆菌、青霉菌及石榴干腐病菌的抑菌实验评价其抑菌活性。结果显示，枣核木醋液中含有35 种化合物，主要为酚类、酮类、有机酸类、醛类和杂环化合物等，其中含量最多的是酚类、酮类化合物和有机酸，三者占总检出成分的71.01%。枣核木醋液对大肠杆菌、青霉菌及石榴干腐病菌均有抑制作用，并呈现剂量依赖效应，对3 种菌的最小抑菌浓度分别为1.25%、2.5%和0.625%。表明枣核木醋液具有较强的抑菌活性，初步分析酚类物质和有机酸是其抑菌的主要有效成分。

枣核；木醋液；化学成分；抑菌活性

木醋液是含纤维素、半纤维素的植物材料干馏时收集的液体混合物经静置并分离出木焦油后的澄清红褐色液体，具有醋酸的酸味和烟熏气味［1］。木醋液在国外已获得广泛应用，采取不同的精制方法得到的木醋液，作为医药原料、食品添加剂、染料原料、脱臭剂、农药原料、土壤改良剂等，还开辟了饮料添加剂、沐浴添加剂等用途［2］。木醋液作为抑菌剂的应用也相当广泛，早在1957年日本国家研究会就进行过控制腐生菌的实验，确认木醋液对抑制腐生菌有效，木醋液稀释液（酸度0.1%）杀菌效果与0.03%乌斯普龙溶液和0.08%西力生溶液相同。1994年，日本学者［3-4］实验发现木醋液对腐霉属、青霉属、丝核菌、核盘菌属、镰刀菌属等多类病原菌有抑制作用。

枣（Ziziphus jujuba Mill.），鼠李科植物，落叶灌木或小乔木。在国内广为栽培，被称为“铁杆作物”。其成熟果实红枣是一种药食同源食品，随着人们对红枣营养价值和药用价值的深入认识，红枣也被加工成各种食品，如去核即食枣、红枣汁［5］、红枣酒等［6］。在红枣加工中会产生副产物枣核，研究表明，枣核中含有酚类［7-8］、类黄酮［9］及总皂苷［10］等活性物质，具有开发利用价值。但枣核的木质化程度高、质地坚硬，通常被大量废弃，未能得到充分利用，造成资源浪费。

木醋液的组分、性质与用途随原料的种类及制作工艺的不同而存在差别［11］，除各种木材制取木醋液外［12-14］，也有一些果壳被制成木醋液，如核桃壳［11］和苦杏壳木醋液［15］。目前，对以枣核为原料制取木醋液及其化学成分和抑菌活性的研究鲜见报道，本研究以枣核为原料，采用干馏法制取枣核木醋液，分析了其化学成分及抑菌活性，以期为枣核资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枣核为枣庄山亭区店子镇产长红枣枣核，洗净后自然风干。

大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922、青霉菌（Penicillium glaucum）CGMCC1842、石榴干腐病菌（Coniella granati）Zy06 枣庄学院生命科学学院微生物实验室。

无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醚、硫酸铜、无水硫酸钠均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；干馏釜 南京林业大学林产化工学院；SPX-300B型生化培养箱 广州市海辉实验仪器有限公司；7000B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 枣核木醋液的制取

参考吴哲洙等［16］方法，将风干枣核放入干馏釜中，以1 kW的功率持续加热，温度控制在150～400 ℃范围，在冷凝装置中通入冷却水，冷凝干馏时产生的气体，收集馏出液，静置30 d，木醋液分离为3 层，上层为少量油状物，中层澄清液，底层为黏稠的木焦油等杂质。用虹吸法取中层的澄清液，并与5%的活性炭粉末混合，搅拌10 min，静置3 d，过滤得精制枣核木醋液。

1.3.2 总酚含量测定

取精制的枣核木醋液用蒸馏水稀释200 倍，然后采用Folin-酚法［17］测定其总酚含量，以邻苯二酚为标准品。

1.3.3 总酮含量测定

取精制的枣核木醋液用蒸馏水稀释20 倍，然后采用Al（NO3）3-NaNO2比色法［18］测定其总酮含量，以甲基环戊烯醇酮为标准品。

1.3.4 有机酸含量测定

采用酸碱滴定法，有机酸含量以醋酸质量分数计［19］。

1.3.5 枣核木醋液的有机成分分析

1.3.5.1 枣核木醋液的预处理

参照史冠昭等［11］方法预处理枣核木醋液，取精制木醋液30 mL，每次用10 mL乙醚，萃取6 次，合并乙醚萃取液，加入2.0 g无水硫酸钠吸收其中的水分，过滤后使用旋转蒸发仪回收乙醚，萃取液浓缩至3 mL，用作气相色谱-质谱待测样品。

1.3.5.2 气相色谱-质谱测定

采用直接进样法［11］对枣核木醋液萃取浓缩液成分用气相色谱-质谱法进行分析，具体气相色谱条件：进样口温度220 ℃，柱温60 ℃，恒温2 min后，以6.0 ℃/min速率升温至240 ℃，恒温8 min；分流进样80∶1；载气流速1.0 mL/min。电子电离源，电子能量70 eV，质量扫描范围35～400 u，质谱标准库NIST11。

1.3.6 抑菌实验

1.3.6.1 大肠杆菌和青霉菌抑菌实验

采用滤纸片法测定大肠杆菌和青霉的抑菌圈直径［20］。大肠杆菌菌种在LB液体培养基中于37 ℃振荡培养24 h；将已经活化的青霉菌菌株，选取4 环菌苔，用无菌水制成含菌数约107～109CFU/mL的菌悬液。LB固体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基灭菌后倒在直径9 cm的培养皿中，取100 µL上述菌液加在凝固的培养基上，并涂布均匀。将枣核木醋液原液用无菌水分别稀释2、4、8 倍，并标记为M1、M2、M3，把直径7 mm的滤纸圆片放置在上述3 种体积分数的枣核木醋液中浸泡。取浸泡好的滤纸片贴于已涂菌的培养基表面，每个体积分数设5个重复，另用灭菌水代替样品设置空白对照，大肠杆菌以效价10 U/mL的庆大霉素作为阳性对照，青霉菌以5% CuSO4溶液作为阳性对照。37 ℃倒置培养，大肠杆菌培养24 h，青霉菌培养72 h，十字交叉法测量其抑菌圈直径，以抑菌圈的大小表示抑菌活性。抑菌率的计算公式如下：

1.3.6.2 石榴干腐病菌抑菌实验

采用菌丝生长速率抑制法［21］测定石榴干腐病菌的菌落直径。将PDA培养基熔化冷却至50 ℃倒入培养皿（规格为6 cm），每皿10 mL，冷却凝固后，用移液枪取50 µL不同体积分数（M1、M2、M3）木醋夜于培养皿中，用涂布棒均匀涂开，另用灭菌水代替样品作为空白对照，以5% CuSO4溶液作为阳性对照。用灭菌打孔器取直径6 mm的圆形菌片，移到制备好的含各处理样液的平板上，每个处理重复5 次，最后将各皿放入28 ℃培养箱培养72 h，取出后测定其菌落直径。抑菌率的计算公式如下：

1.3.7 最小抑菌浓度测定

采用2 倍稀释法［22］，将精制的枣核木醋液原液用10%吐温-80稀释至体积分数100%～3.125% 6 个梯度，然后吸取1 mL加入9 mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，振荡充分混匀倒平板，使培养基中木醋液最终体积分数为10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%及0.312 5%。待培养基冷却后，用预先培养好的菌悬液划线接种，分别按前述条件培养，每一体积分数均做3 组平行实验。观察结果，从无菌生长的培养皿中找出最小抑菌浓度的培养皿，即为提取液的最小抑菌浓度。以10%吐温-80作为对照。

2 结果与分析

2.1 枣核木醋液中总酚、总酮及有机酸含量

分别分析得到枣核木醋液中总酚含量为26.3 mg/mL，总酮含量为25.8 mg/mL，有机酸含量为7.81%。徐社阳等［23］报道工业品木醋液中有机酸质量分数占到5.13%，其他有机成分的相对含量为4.97%。史冠昭等［11］所制核桃壳木醋液中有机酸质量分数最高为6.31%，并认为干馏温度越高有机酸含量越低。相比较，本研究所制枣核木醋液有机酸含量相对较高。

2.2 枣核木醋液气相色谱-质谱分析结果

图1 枣核木醋液气相色谱-质谱总离子流图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the pyroligneous acid

如图1所示，经Origin 8.0和人工解析确定物质种类，根据峰面积归一法确定物质的相对含量，共检出35 种成分，具体成分见表1。

表1 精制枣核木醋液气相色谱-质谱分析结果Table1 Results of GC-MS analysis of the pyroligneous acid

由表2可以看出，枣核木醋液的乙醚萃取物中，含量最多的是酚类化合物，共9 种，总含量为35.93%；其次是酮类化合物，共14 种，总含量为26.88%；呋喃类衍生物4 种，占13.41%；有机酸3 种，总含量为8.20%，其中主要是乙酸，占6.40%；酯类化合物共3 种，占7.76%；此外，还含有少量的醇类、烷类和含氮有机化合物。酚类和酮类化合物含量达到62.81%，是枣核木醋液中的主要成分。

2.3 枣核木醋液抑菌作用

2.3.1 对大肠杆菌抑制效果

表2 不同 体积 分数 精制 枣核 木醋 液对 大肠 杆菌 的抑 制效 果Table 2 Antibacterialactivityaga in st E.c oli of the pyrolign eousacid at differentc on centrati on s

由表2可以看出，3 种体积分数的枣核木醋液对大肠杆菌均有抑制作用，其中，M1对供试大肠杆菌的抑制作用略高于阳性对照，M2也具有显著的抑菌效果，M3的抑菌效果相对较差。枣核木醋液对大肠杆菌的抑制作用表现明显的剂量依赖效应。

2.3.2 对青霉菌抑制效果

表3 不同 体积 分数 枣核 木醋 液对 青霉 菌的 抑制 效果Table 3 Antimicrobiala ctivityaga in stP enici llium glaucum of the py rol ign eou sa cid at differentc on centrati on s

由表3可以看出，3 种体积分数的枣核木醋液对青霉菌均有一定的抑制作用，其中，M2的抑菌作用与阳性对照相同，M1的抑菌作用最强，效果显著优于5% CuSO4溶液阳性对照，M3的抑菌作用相对较弱。枣核木醋液的稀释倍数与抑菌活性呈反相关。

2.3.3 对石榴干腐病菌抑制效果

表4 不同体积分数枣核木醋液对石榴干腐病菌的抑制效果Table 4 Antimicrobial activity against Coniellagranatio f the pyroligneous acid at different concentrations

如表4所示，采用生长速率抑制法评价抑菌活性，菌落直径越小表示抑菌效果越明显。可以看出，M1、M2和M3对石榴干腐病菌均有一定的抑制作用。其中M1的抑菌作用最强，效果要明显好于5% CuSO4溶液阳性对照，且存在显著差异，M2的抑菌作用与阳性对照相当，M3的抑菌作用相对较弱。枣核木醋液对石榴干腐病菌的抑制作用也表现明显的剂量依赖效应。

2.3.4 最小抑菌浓度测定结果

枣核木醋液对3 种供试菌株均有抑菌效果，但对不同供试菌的最小抑菌浓度有差别，对石榴干腐病菌有较好的效果，最小抑菌浓度为0.625%，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1.25%，对青霉菌的抑菌作用相对较弱，其最小抑菌浓度为2.5%，和上述抑菌实验的结果有一致性。

3 讨论与结论

采用常规化学分析的方法测定出枣核木醋液中总酚含量为26.3 mg/mL，总酮含量为25.8 mg/mL，有机酸体积分数为7.81%。进一步通过气相色谱-质谱分析其成分及相对含量，其中含量最多的是酚类化合物，其次为酮类和有机酸，三者含量占总检出成分的71.01%，两种结果相互印证。本研究从枣核木醋液中共检出35 种化合物，除酚类、有机酸类、酮类外，还有呋喃类杂环化合物、醇类、酯类和含氮有机化合物。毛巧芝等［24］在170～370 ℃温度段苦杏壳木醋液中检出化合物27 种，王元等［25］在90～190、190～300 ℃及300～480 ℃ 3 个温度段的核桃壳木醋液中分别检出13、42 种和37 种物质。对比分析，不同植物材料的木醋液中化合物的类别基本相同，主要是酸类、酚类、醛类、酮类、醇类、呋喃和酯类等，具体物质所占的比例存在差别，如本研究检出枣核木醋液中酚类化合物相对含量（质量分数）为35.93%，酮类化合物为26.88%，有机酸为8.20%；而已有研究［24］苦杏壳木醋液中酚类物质相对含量（质量分数）为42.83%，酸类为23%，酮类为6.23%。王元等［25］发现核桃壳木醋液中乙酸的相对含量随收集温度的升高逐渐减少。说明不同植物材料、不同干馏工艺会影响所制木醋液的化学成分。

抑菌实验和最小抑菌浓度实验的结果均表明，枣核木醋液对细菌、霉菌及植物致病菌均具有抑制作用，且表现剂量依赖效应。木醋液中的乙酸是典型的抑菌物质，此外，酚类物质一般具有较强的抗菌活性，简单的酚类化合物如石炭酸（苯酚），是人们熟知的一种常用杀菌剂。枣核木醋液中酚类物质含量较高，因此，可以推测枣核木醋液中酚类化合物是抑菌的主要成分。当然，抑菌作用也可能为多种物质的协同作用结果。

枣核木醋液作为天然抗菌剂，在食品、医药、环境保护及农业病害防治等方面具有进一步开发利用的价值。尤其近年来设施农业在我国得到快速发展，在给农业带来可观经济效益的同时，由于保护设施内特殊的微生态环境，极易发生由霉菌和细菌引起的病害，使用化学农药虽然可以收到良好的防治效果，但容易造成农药残留，木醋液作为一种天然的植物源杀菌剂，无疑具有很大的发展潜力。

综上所述，枣核木醋液所含化学成分比较丰富，对细菌和真菌具有较强的抑菌活性，利用枣核生产木醋液可以为枣核资源的利用开辟新途径，提高资源利用率，也为农业病害防治提供安全环保的产品。

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Chemical Constituents and Antimicrobial Activities of Pyroligneous Acid from Jujube Pit

ZHANG Lihua1， WANG Dan1， GONG Wenzhe2， TANG Tingting1
（1.College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160， China；2.Zaozhuang Municipal Environmental Protection Bureau， Zaozhuang 277800， China）

To achieve the comprehensive utilization of jujube pit， pyroligneous acid was prepared by pyrolyzing jujube pit at 150 to 400 ℃ to analyze its chemical constituents by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） and test its antimicrobial activities against Escherichia coli， Penicillium glaucum and Coniella granati.The results showed that a total of 35 compounds were detected by GC-MS analysis from the pyroligneous acid， mainly phenols， ketones， organic acids，aldehydes， heterocyclic compounds， etc.Among them， the most abundant were phenols， ketones and organic acid， which accounted for 71.01% of the total amount of compounds detected.All pyroligneous acids with three different concentrations showed significant antimicrobial activities in a dose-dependent manner.The minimum inhibitory concentrations （MIC） of the pyroligneous acid against Escherichia coli， Penicillium glaucum and Coniella granati were 1.25%， 2.5% and 0.625%，respectively.These results preliminarily suggested that phenols and organic acids were the active components responsible for the antimicrobial activity of pyroligneous acid.

jujube pit； pyroligneous acid； chemical constituents； antimicrobial activity

10.7506/spkx1002-6630-201614021

S482.2

A

1002-6630（2016）14-0123-05

张立华， 王丹， 宫文哲， 等.枣核木醋液化学成分分析及其抑菌活性［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 123-127.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614021. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lihua， WANG Dan， GONG Wenzhe， et al.Chemical constituents and antimicrobial activities of pyroligneous acid from jujube pit［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 123-127.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614021. http://www.spkx.net.cn

2015-11-01

山东省自然科学基金项目（ZR2013BL018）

张立华（1969—），男，教授，博士，研究方向为植物资源开发及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com