钛胶RP-HPLC法同时测定5 种维生素

耿 瑛，李 荣*，姜子涛，张发博（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）



钛胶RP-HPLC法同时测定5 种维生素

耿 瑛，李 荣*，姜子涛，张发博
（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

采用钛胶反相色谱柱，建立高效液相色谱法同时测定5 种维生素：烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素含量的检测方法。研究5 种维生素的保留行为与磷酸缓冲盐pH值、缓冲盐类型及浓度、柱温和流速的关系，得出了最优色谱条件：于波长210 nm处检测生物素和钴胺素，于波长270 nm处检测烟酸、烟酰胺和叶酸，磷酸盐pH 7.0，浓度5.0 mmol/L，柱温50 ℃，流速0.8 mL/min。分析5 种维生素保留的热力学参数焓、熵和吉布斯自由能。烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素标准曲线线性良好（R2＞0.999 0）；烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素的检出限分别为6、10、20、22、8 ng/mL；5 种物质的相对标准偏差均低于1.36%；加标回收率范围为92.30%～107.20%。方法的精密度和准确度均可满足高效液相色谱法的测定要求。

钛胶反相色谱柱；高效液相色谱法；维生素

随着高效液相色谱在分析领域的应用越来越广，色谱填料的发展也引起越来越多的关注。现在普遍使用的是硅胶色谱填料，但是它适用的pH值范围窄（pH值通常为3～10），并存在对碱性化合物不可逆吸附的缺点。而能克服其弱点的钛胶色谱填料，具有极其稳定的化学性质，在pH 1～14范围都能够稳定存在［1］，对碱性化合物具有很好的分离效果［2］，钛胶基质可以与含有羟基、磷酸、羧酸等基团的化合物进行结合［3］，且钛胶色谱柱具有热稳定性，升高温度使色谱柱具有较低的柱压，有利于分析物的分离分析，利用这一特性可测出分析物保留时的热力学常数ΔH°、ΔS°和ΔG°。由于这些优于硅胶色谱柱的特点，近年来钛胶作为色谱填料，吸引了众多的国内外学者对其进行研究［4-8］。

Zhou Ting等［9］用钛胶色谱柱分析了核苷酸以及它的中间体；Zhao Jing等［10］分析了大豆蛋白中的卵磷脂；Ozawa等［11］分析了嘌呤类化合物；Žižkovský等［12］分析了昂丹司琼及其相关的化合物；Liu Tenghao等［13］测定了饮料中的甜味剂；包荣等［14］分析了饮料中的咖啡因含量；杜丽霞等［15］分析了饮料中的柠檬黄含量；孙倩倩等［16］测定了饮料中的柠檬酸含量。这些研究表明，钛胶是具有良好发展前景、性能优异的色谱填料。

维生素对于维护人体健康、预防及治疗多种疾病都有着重要的作用，目前出现了越来越多补充维生素的食品及保健品，因此对于维生素含量的分析与测定具有重要意义。文献中采用硅胶色谱柱测定维生素的方法，大多采用了离子对试剂：辛烷磺酸钠［17］、庚烷磺酸钠［18-19］、三氟乙酸［20-22］和醋酸铵［23］。离子对试剂和色谱柱固定相结合会产生不可逆吸附，进而影响固定相的活性位点，对色谱柱造成不可逆的伤害，缩短色谱柱的使用寿命。同时，由于VB12在维生素片中的含量少，文献报道的方法对样品中VB12含量的检测低于检出限［20］，或将VB12单独进行分析，不能与其他维生素同时分析［19］，影响了分析效果。Tan等［24］采用钛胶正相色谱柱分析了VB1，钛胶反相色谱柱对其他维生素的分析鲜见报道。

实验采用钛胶反相色谱柱建立对5 种维生素分离分析新方法，结果表明此法对5 种维生素能较好地分离检测，同时，钛胶色谱柱有较高的灵敏度，能够不用复杂的前处理过程，可直接检测出样品中的钴胺素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2 种维生素片、4 种饮料样品 市购；烟酸标准品（CAS：59-67-6；99.5%）、烟酰胺标准品（CAS：98-92-0；99.0%） 天津市光复精细化工研究所；生物素标准品（CAS：58-85-5；98.0%） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；叶酸标准品（CAS：59-30-3；98.0%）、钴胺素标准品（CAS：68-19-9；98.0%） 北京博奥拓达科技有限公司；甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（色谱级） 天津市科密欧化学试剂有限公司；Heal Force SMART-N纯水机上海圣科仪器设备有限公司；0.45 μm滤膜 上海半岛实业有限公司净化器材厂。

1.2 仪器与设备

1100型高效液相色谱仪（可变波长检测器）美国Agilent公司；FA1104N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；Spectrometer Lambda 25 UV/VIS分光光度计美国Perkin-Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 标准溶液的配制

2.0 mg/mL烟酸、烟酰胺和钴胺素：准确称取20.0 mg标准品，用超纯水溶解并定容至10 mL。2.0 mg/mL生物素和叶酸：准确称取20.0 mg标准品，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL。储备液置于4 ℃冰箱储存避光保存。标准混合溶液用储备液按一定比例混合配制，用0.1 mol/L盐酸调节pH值为7.0。

不同pH值和浓度的磷酸缓冲盐溶液由50 mmol/L Na2HPO4和50 mmol/L NaH2PO4配制。

1.3.1.2 样品处理

维生素片：取若干片维生素片，用研钵研细，准确称取粉末0.200 0 g，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容到10 mL，超声溶解20 min，3 000 r/min离心15 min，取上清液5 mL，用0.1 mol/L盐酸调节pH值为7.0，定容到10 mL，过0.45 μm微孔滤膜后进样分析。饮料：取5 mL饮料，超声脱气，过0.45 μm微孔滤膜后进样分析。

1.3.2 色谱条件

Titania Sachtopore-RP色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm，300 Å）。于波长210 nm处检测生物素和钴胺素，于波长270 nm处检测烟酸、烟酰胺和叶酸。具体波长检测为：0～3.15 min，270 nm；3.15～4.5 min，210 nm；4.5～10 min，270 nm；10～12 min，210 nm；12～20 min，270 nm。流动相流速0.8 mL/min。

流动相由水（溶液A）、甲醇（溶液B）和磷酸缓冲盐（溶液C）组成，C在流动相中的比例始终保持为10%。流动相在0～2 min时，A为90%；2～12 min时，A 由90%降低到45%。以保留时间定性，峰面积定量。

1.3.3 标准曲线的绘制

配制一系列不同质量浓度的混合标准溶液，不同质量浓度的混合标准溶液分别取10 μL进样。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，考察方法的线性范围。

1.3.4 热力学参数的测定

按照方法1.3.2节色谱条件，采用柱温箱在5 个不同温度条件下（30、40、50、60、70 ℃）对维生素进行分离。根据公式（1）van't Hoff方程［12，25］，当lnk′和1/T呈线性关系时，由斜率和截距可以计算维生素保留时间的焓变（ΔH°）和熵变（ΔS°）；不同温度条件下的吉布斯自由能ΔG°由公式（2）计算：

式（1）中：k′为容量因子；R为气体常数；T为绝对温度/K；φ为相比。

按公式（3）计算容量因子k′：

式中：t为分析物的保留时间/min；to为色谱柱的死时间/min；通过测定不同色谱柱作用的水的保留时间作为死时间。

按公式（4）计算相比φ：

式中：VS是色谱柱中固定相的体积/mL；Vo是色谱柱的死体积/mL。

按公式（5）、（6）计算VS、Vo：

式中：VCOL为色谱柱的几何体积/mL；F为流动相的流速/（mL/min）。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

图1 5 种维生素在200 ～400 nm的紫外吸收光谱Fig.1 UV spectra of five vitamins within200-400 nm

用紫外分光光度计分别对5 种维生素标准溶液于波长200～400 nm处进行扫描，如图1所示，根据吸收曲线选择生物素和钴胺素选择于波长210 nm处进行检测，烟酸、烟酰胺和叶酸于波长270 nm处进行检测。

2.2 pH值及其缓冲盐的选择

图2 保留时间（a）、半峰宽（b）、柱效（c）与磷酸缓冲盐pH值的关系Fig.2 Effects of phosphate buffer pH on retention time（a）， peak width at half height（b）and the number of plates （c）

按照1.3.2节方法，在磷酸缓冲盐浓度5.0 mmol/L、流速0.8 mL/min、柱温25 ℃时，选择磷酸缓冲盐pH值范围为5.0～8.0对5 种维生素进行分析，如图2所示。

由图2a可以看出，分析物在pH值为5.0时的保留时间都比较长，因为离子交换作用，PO43-离子与TiO2的表面结合，导致分析物的阳离子强的保留。当pH值大于5.0时，分析物分子脱质子化，离子交换作用减弱，因此，保留时间随着pH值的增大而减小，与Žižkovský等［12］分析的昂丹司琼在钛胶柱上的保留行为一致；随着pH值增大，半峰宽呈现减小的趋势，在pH值为7.0和8.0时最好（图2b）；理论塔板数呈现增加的趋势，在pH值为7.0 和8.0时最好（图2c）；烟酰胺、叶酸和钴胺素之间的分离效果很好，但是，在pH值为7.0时，生物素和烟酸的分离度为3.16，而pH值为8.0时，生物素和烟酸的分离度为2.74。综合考虑，选择pH值为7.0对5 种维生素进行分析。

2.3 磷酸缓冲盐浓度的选择

按照1.3.2节方法，在pH 7.0、流速0.8 mL/min、柱温25 ℃时，分别选取流动相中磷酸缓冲盐浓度为2.5、5.0、7.5 mmol/L和10.0 mmol/L进行分析，如图3所示。

图3 保留时间 （ a）、半峰宽 （b ）、柱效 （c）与磷酸缓冲盐浓度的关系Fig.3 Effect of phosphate buffer concentration on retention time （a），peak width at half height （b） and the number of plates （c）

由图3a可以看出，随着磷酸盐浓度的增大，烟酸、生物素和烟酰胺的保留时间变化不大，而叶酸和钴胺素的保留时间逐渐减小，因为磷酸根作为Lewis碱可以与钛胶表面上的Lewis酸位点结合，这种竞争关系减弱了维生素在钛胶上的保留；由图3b、c可以看出，在2.5～7.5 mmol/L时，半峰宽呈减小趋势，柱效呈增加趋势，但当磷酸盐增加到7.5 mmol/L，这种减小的趋势会有所降低，当磷酸缓冲盐浓度增加到10.0 mmol/L时，烟酸、生物素、烟酰胺的半峰宽会增加，烟酸、生物素、烟酰胺和钴胺素的柱效降低。综合考虑，选择磷酸盐浓度为5.0 mmol/L。

2.4 柱温的影响

2.4.1 柱温的选择

按照1.3.2节方法，在pH 7.0、磷酸盐浓度5.0 mmol/L、流速0.8 mL/min时，选择柱温30～70 ℃对5 种维生素进行分析，如图4所示。

图4 保留时间 （a）、半峰宽 （b ）、柱效 （c）与柱温的关系Fig.4 Effect of column temperature on retention time （a）， peak width at half height （b） and the number of plates （c）

从图4a可以看出，随着色谱柱温度的升高，维生素的保留时间减少，说明5 种维生素在钛胶反相色谱柱上的保留过程是放热的。随着温度的升高，保留时间会减小，烟酸和生物素保留时间减小非常少，烟酰胺和钴胺素保留时间有所减少，叶酸保留时间明显减少；由图4b可以看出，生物素、烟酰胺和钴胺素的半峰宽减小，烟酸的半峰宽变化很小，而叶酸的半峰宽在50 ℃时最小，超过50 ℃半峰宽很宽；同时，增加柱温可以减小柱压，峰形变好；但是当温度超过50 ℃时，烟酸、烟酰胺和叶酸的柱效会降低（图4c），同时，烟酸和生物素的分离效果会变差，综合考虑，选择柱温为50 ℃。

2.4.2 热力学研究

按照1.3.4节方法，在30～70 ℃对5 种维生素进行分析，如图5，表1、2所示。

图5 不同温度条件下钛胶色谱柱分离分析物的 v a n 't Ho f f曲线Fig.5 van't Hoff plots for five analytes on titania column at different temperatures

表1 分析 物的 回归 参数Table 1 Regressi on parameters for theanalytes

由图5和表1可以看出，钛胶色谱柱在不同温度时对5种维生素的分离呈现很好的线性，说明在30～70 ℃的温度范围内钛胶柱对它们的分离机理是一致的。

表2 分析物在323.15K 的熵、焓和吉布斯自由能Table 2 St and ard enthalpy（ ΔH °）， entropy （Δ S°） and Gibbsfree en er gy （ΔG °） at3 23.15 K

由表2可以看出，钛胶色谱柱对上述5 种维生素的分离是由不同的ΔH°和ΔS°决定的。烟酸、生物素和烟酰胺的ΔG°为正值，说明它们的保留行为是由ΔS°驱动的；叶酸和钴胺素的ΔG°为负值，说明它们的保留行为是由ΔH°驱动的；ΔG°为负值表明分析物从流动相进入固定相是热力学自发过程，ΔG°越小，表明分析物越容易从流动相转移到固定相中，因而导致分析物在钛胶固定相中的保留越强。叶酸和钴胺素的ΔG°是负值，它们的保留也较强，可能是因为它们是具有疏水性苯环的大分子。烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素的ΔG°依次减小，这也从热力学角度验证了分析物的保留顺序。

2.5 流速的选择

按照1.3.2节方法，在pH 7.0、磷酸盐浓度5.0 mmol/L、柱温50 ℃时，选择流速分别为0.6、0.8 mL/min和1.0 mL/min对5 种维生素进行分析，如图6所示。

图6 保留时间 （a）、半峰宽 （b ）、柱效 （c）与流速的关系Fig.6 Effect of flow rates on retention time （a）， peak width at half height （b） and the number of plates （c）

由图6a、b可以看出，流速为0.6 mL/min时，5 种维生素的保留时间都长，半峰宽较宽；流速为1.0 mL/min时，虽然分析的时间缩短，半峰宽会减少，但是烟酸和烟酰胺的柱效降低（图6c），同样也会影响烟酸和生物素的分离效果。综合考虑，选择流速为0.8 mL/min。

综合考虑以上因素，于波长210 nm处检测生物素和钴胺素，于波长270 nm处检测烟酸、烟酰胺和叶酸，磷酸缓冲盐pH 7.0，浓度5.0 mmol/L，柱温50 ℃，流速0.8 mL/min对5 种维生素进行分析，如图7所示。

图7 混合标准溶液的分离色谱图Fig.7 Chromatogram of mixed vitamin standard solutions

2.6 方法验证

按照方1.3.3节法，测定5 种维生素的线性范围。结果显示烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素的质量浓度分别在0.020～80.0、0.033～400.0、0.066～80.0、0.073～80.0 μg/mL和0.026～80.0 μg/mL范围内时，标准曲线线性良好。分别对最小质量浓度的标准储备液进行适当稀释后测定，得到检出限。对0.020 μg/mL的烟酸、0.033 μg/mL的生物素、0.066 μg/mL的烟酰胺、0.073 μg/mL的叶酸和0.026 μg/mL的钴胺素重复测定8 次，得出方法的精密度，如表3所示。

表3 5 种维生素的线性回归方程、相关系数、检出限和精密 度（n=8）Table3 L in earregressi on equati on s，c orrelati on coefficients， LODs an d pr ec isi on （RS D） （n= 8）

2.7 样品测定结果

图8 样品1～6的色谱图Fig.8 Chromatograms of samples1-6

在最优色谱条件下，5 种维生素在维生素片和功能性饮料中测定结果如表4和图8所示。每个样品加入3 个不同质量浓度的标准混合溶液，测定加标回收率（n=3）。由表4可以看出，加标回收率范围为92.30%～107.20%。由图8可知，在本实验提出的色谱条件下，同时实现对5 种维生素的色谱分离是切实可行的。

表4 样品测定结果和加标回收率Table 4 Vitam in c on tents of realsamples and s piked recoveries

续表4

3 结 论

实验建立了同时分离分析5 种维生素的方法，研究5 种维生素的保留行为与磷酸缓冲盐pH值、缓冲盐浓度、柱温和流速的关系，得出了最优色谱条件：检测波长210 nm和270 nm，磷酸盐pH值7.0，浓度5.0 mmol/L，柱温50 ℃，流速0.8 mL/min，同时由柱温计算出维生素从流动相转移到固定相的ΔH°、ΔS°和ΔG°，这从热力学角度验证了分析物的保留顺序。5 种维生素的标准曲线线性良好（R2＞0.999 0），烟酸、生物素、烟酰胺、叶酸和钴胺素的检出限分别为6、10、20、22、8 ng/mL，5 种物质的相对标准偏差都低于1.36%，加标回收率范围在92.30%～107.20%之间。同时，本法样品前处理过程简单，操作方便，结果准确可靠。

［1］ KAWAHARA M， NAKMURA H， NAKAJIMA T， et al.Preparation and evaluation of octadecyl titania as column-packing material for high-performance liquid chromatography［J］.Microchemical Journal，1994， 49（2/3）: 362-367.DOI:10.1006/mchj.1994.1047.

［2］ KURGANOV A， TRUDINGER U， ISAEVA T， et al.Native and modified alumina， titania and zirconia in normal and reversed-phase high-performance liquid chromatography［J］.Chromatographia， 1996，42（3/4）: 217-222.DOI:10.1007/BF02269656.

［3］ TAN J， LI R， JIANG Z T.Determination of melamine in liquid milk and milk powder by titania-based ligand-exchange hydrophilic interaction liquid chromatography［J］.Food Analytical Methods， 2012，5: 1062-1069.DOI:10.1007/s12161-011-9350-x.

［4］ TANI K， SUZUKI Y.Influence of titania matrix on retention behaviour in reversed-phase liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A， 1996， 722（1/2）: 129-134.DOI:10.1016/0021-9673（95）00456-4.

［5］ ELLWANGER A， MATYSKA M T， ALBERT K， et al.Comparison of octadecyl bonded titania phases［J］.Chromatographia， 1999， 49（7/8）: 424-430.DOI:10.1007/BF02467618.

［6］ PESEK J J， MATYSKA MT， RAMAKRISHNAN J.Synthesis and characterization of titania based stationary phases using the silanization/hydrosilation method［J］.Chromatographia， 1997，44（9/10）: 538-55.DOI:10.1007/BF02466748.

［7］ MIR L， AMLOUKA A， ELALOUI E， et al.Preparation and optical characterization of transparent， microporous TiO2xerogel monoliths［J］.Materials Science and Engineering B， 2008， 146（1/2/3）: 69-73.DOI:10.1016/j.mseb.2007.07.055.

［8］ WEI J， JIANG Z T， LI R， et al.Preparation of titania monolith column and application in determination of benzoic acid by HILIC［J］.Chromatographia， 2012， 75（11/12）: 563-569.DOI:10.1007/s10337-012-2230-8.

［9］ ZHOU T， LUCY C A.Hydrophilic interaction chromatography of nucleotides and their pathway intermediates on titania［J］.Journal of Chromatography A， 2008， 1187: 87-93.DOI:10.1016/ j.chroma.2008.02.027.

［10］ ZHAO J， JIANG Z T， LU G R， et al.Determination of phosphatidylcholine in soybean lecithin samples by high performance liquid chromatography on titania［J］.Analytical Methods， 2010， 2（11）: 1779-1783.DOI:10.1039/C0AY00419G.

［11］ OZAWA M， TANI K， TACHIBANA M， et al.Retention behavior of purine-like compounds on titania and the effect of organic modifiers content in the mobile phase［J］.Chromatographia， 2010， 72（3/4）: 313-316.DOI:10.1365/s10337-010-1658-y.

［12］ ŽIŽKOVSKYÝ V， KUCERA R， KLIMEŠ J， et al.Titania-based stationary phase in separation of ondansetron and its related compounds［J］.Journal of Chromatography A， 2008， 1189: 83-91.DOI:10.1016/j.chroma.2007.12.017.

［13］ LIU T H， JIANG Z T， LI R， et al.Simultaneous determination of cyclamate， acesulfame， and aspartame in beverages by titania-based RP-HPLC［J］.Food Analytical Methods， 2014， 7（7）: 1400-1406.DOI:10.1007/s12161-013-9762-x.

［14］ 包荣， 李荣， 姜子涛.钛胶反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因［J］.中国食品添加剂， 2012（5）: 214-218.DOI:10.3969/ j.issn.1006-2513.2011.05.035.

［15］ 杜丽霞， 姜子涛， 李荣.钛胶反相高效液相色谱法测定饮料中的柠檬黄［J］.食品研究与开发， 2013， 34（5）: 69-73.DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2013.05.019.

［16］ 孙倩倩， 姜子涛， 李荣， 等.钛胶反相高效液相色谱法测定饮料中的柠檬酸［J］.中国酿造， 2012， 31（7）: 151-155.DOI:10.3969/ j.issn.0254-5071.2012.07.042.

［17］ ZAFRA-GÓMEZ A， GARBALLO A， MORALES J A， et al.Simultaneous determination of eight water-soluble vitamins in supplemented foods by liquid chromatography［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（13）: 4531-4536.DOI:10.1021/jf060346e.

［18］ RUDENKO A O， KARTSOVA L A.Determination of water-soluble vitamin B and vitamin C in combined feed， premixes， and biologically active supplements by reversed-phase HPLC［J］.Journal of Analytical Chemistry， 2010， 65（1）: 71-76.DOI:10.1134/S1061934810010132.

［19］ RADA A， JASMINA B， OLIVERA C， et al.RP-HPLC determination of vitamins B1， B3， B6， folic acid and B12in multivitamin tablets［J］.Journal of the Serbian Chemical Society， 2005， 70（10）: 1229-1235.DOI:10.2298/JSC0510229A.

［20］ HEUDI O， KILINC T， FONTANNAZ P.Separation of water-soluble vitamins by reversed-phase high performance liquid chromatography with ultra-violet detection: application to polyvitaminated premixes［J］.Journal of Chromatography A， 2005， 1070（1/2）: 49-56.DOI:10.1016/ j.chroma.2005.02.033.

［21］ CIULU M， SOLINAS S， FLORIS I， et al.RP-HPLC determination of water-soluble vitamins in honey［J］.Talanta， 2011， 83（3）: 924-929.DOI:10.1016/j.talanta.2010.10.059.

［22］ KLEJDUS B， PETRLOVÁ J， POTEŠIL D， et al.Simultaneous determination of water- and fat-soluble vitamins in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection［J］.Analytica Chimica Acta， 2004， 520（1/2）: 57-67.DOI:10.1016/j.aca.2004.02.027.

［23］ MORENO P， SALVADÓ V.Determination of eight water- and fatsoluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by highperformance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2000， 870: 207-215.DOI:10.1016/S0021-9673（99）01021-3.

［24］ TAN J， LI R， JIANG Z T.Determination of thiamine （vitamin B1）in pharmaceutical tablets and human urine by titania-based ligandexchange hydrophilic interaction chromatography［J］.Analytical Methods， 2011， 3（7）: 1568-1573.DOI:10.1039/C1AY05156C.

［25］ KARATAPANIS A E， FIAMEGOS Y C， STALIKAS C D.Study of the behavior of water-soluble vitamins in HILIC on a diol column［J］.Chromatographia， 2010， 71（9/10）: 751-759.DOI:10.1365/s10337-010-1564-3.

Simultaneous Determination of Five Vitamins by Titania-Based RP-HPLC

GENG Ying， LI Rong*， JIANG Zitao， ZHANG Fabo
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）

A new method for simultaneous separation and determination of five vitamins including nicotinic acid （vitamin PP）， biotin （VB7）， nicotinamide （vitamin PP）， folic acid （VB9）， and cyanocobalamin （VB12） using high performance liquid chromatography （HPLC） on a titania-based column has been developed.The influence of buffer pH， buffer type， buffer concentration， column temperature and flow rate on separation efficiency was investigated.The optimized chromatographic conditions were obtained as follows: 5.0 mmol/L phosphate solution at pH 7.0 as buffer solution， column temperature of 50 ℃， and a flow rate of 0.8 mL/min.Biotin and cyanocobalamin were detected at 210 nm and three other vitamins at 270 nm.The thermodynamic parameters enthalpy， entropy and Gibbs free energy were calculated for the retention of the analytes.The proposed method presented good linearity （R2＞ 0.999 0） for the five vitamins.The limits of detection （LODs）for nicotinic acid， biotin， nicotinamide， folic acid and cyanocobalamin were 6， 10， 20， 22， and 8 ng/mL， respectively.The precisions （RSDs） for the five vitamins were less than 1.36%.The recoveries of spiked samples were between 92.30% and 107.20%.The precision and accuracy of this method can meet the requirements of HPLC analysis.

titania-based reverse phase； high performance liquid chromatography （HPLC）； vitamins

10.7506/spkx1002-6630-201614020

TS218

A

1002-6630（2016）14-0116-07

耿瑛， 李荣， 姜子涛， 等.钛胶RP-HPLC法同时测定5 种维生素［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 116-122.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614020. http://www.spkx.net.cn

GENG Ying， LI Rong， JIANG Zitao， et al.Simultaneous determination of five vitamins by titania-based RP-HPLC［J］.Food Science，2016， 37（14）: 116-122.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614020. http://www.spkx.net.cn

2015-12-02

天津市自然科学基金项目（13JCYBJC18700；12JCZDJC34100）

耿瑛（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：gengying92@126.com

*通信作者：李荣（1962—），女，教授，学士，研究方向为食品分析。E-mail：lirong@tjcu.edu.cn