Folin-Ciocalteu比色法测定乌饭树叶中多酚含量

陈瑞娇

（韶关学院 英东生命科学学院， 广东 韶关 512005）



Folin-Ciocalteu比色法测定乌饭树叶中多酚含量

陈瑞娇

（韶关学院 英东生命科学学院， 广东 韶关 512005）

摘要：以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法测定乌饭树叶中的多酚含量.结果表明，没食子酸质量浓度在0～0.10 mg/mL范围内与其吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y=9.755 7x+0.003 4，R=0.999 3，测定方法的平均回收率为 102.85%，相对标准偏差（RSD）为 1.03%.该方法精密度高，重复性及稳定性好，可用于乌饭树叶中多酚含量的测定.按照本方法测定乌饭树叶中多酚的平均含量为 79.47 mg/g（RSD =1.13 %）.

关键词：Folin-Ciocalteu比色法；乌饭树叶；多酚

乌饭树（Vaccsnium bracreatum Thunb）属于杜鹃花科乌饭树属（又称越桔属）常绿灌木，又名南烛，是一种药食兼用的植物［1-2］.全国各地均有分布，尤其以长江流域以南山区分布最多.《本草拾遗》中记载“南烛枝叶，味苦平，无毒，止泄除睡，坚筋益气力，久服轻身长年，令人不饥，变白去老”.乌饭树叶富含花青素和槲皮素为代表的植物多酚类化合物［2］，众多的研究表明，植物多酚类化合物具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抑制心血管疾病等等［3-4］.因此，测定乌饭树叶中多酚含量对于乌饭树叶药用价值的评价具有重要意义，目前乌饭树叶中多酚含量测定的研究尚未见报道，本研究采用Folin-Ciocalteu比色法测定广东本地野生乌饭树叶中的多酚含量，以期为乌饭树叶资源的进一步开发利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乌饭树叶：8月份采集于广东韶关南雄市全安镇，在55 ℃下烘干，粉碎，过35目筛备用.

没食子酸：百灵威科技有限公司；乙醇、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、磷酸、无水碳酸钠、浓盐酸、过氧化氢等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

FW177中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；JYD-150智能型超声波细胞粉碎机：上海之信仪器有限公司；Ultrospec 2000紫外可见光分光光度计：Amersham Pharmacia Biotech公司；BP221S电子分析天平：德国Sartorius公司；HH-S28S恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂.

1.3 方法

1.3.1 Folin-Ciocalteu 显色剂的配制

称取2 g钼酸钠和8 g钨酸钠于圆底烧瓶中，用56 mL蒸馏水溶解，加入4 mL 85 %的磷酸溶液和8 mL 浓盐酸，文火回流10 h，然后加入1.2 g硫酸锂及6 mL过氧化氢，加热沸腾（开口沸）15 min 至亮黄色，不带绿色为止.冷却，移入100 mL 容量瓶中，蒸馏水定容，装入棕色瓶中，置4 ℃冰箱保存［5］.

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取10.0 mg没食子酸标准品，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，用蒸馏水定容至100 mL，摇匀，即得0.1 mg / mL的没食子酸标准品溶液，低温保存备用.精密量取上述标准品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得到一系列不同浓度的标准品溶液.精密量取不同浓度的标准品溶液各1 mL，分别置10 mL容量瓶中，加蒸馏水3 mL，再加0.5 mL Folin-Ciocalteu显色剂，充分摇匀，加入0.75 mL 20%碳酸钠溶液，混匀，以蒸馏水定容至刻度.在40 ℃下水浴40 min，在 760 nm 处测定吸光度值，可得标准曲线.

1.3.3 样品溶液的制备

称取干燥的乌饭树叶粉末1 g，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL 50%的乙醇，在超声波细胞粉碎机中超声提取，设置超声波功率为150 W，温度为45℃，超声提取时间累计为425 s（超声时间5秒/间隔时间5秒，超声次数85次），提取次数为3次，每次溶剂量均为50 mL，抽滤，合并3次提取滤液，浓缩后转移至50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，作为待测样品溶液.

1.3.4 多酚含量测定

准确吸取1 mL样品溶液于25 mL的容量瓶中加水稀释定溶，再从中吸取1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸馏水3 mL，加0.5 mL 福林试剂，充分摇匀，加入0.75 mL 20%碳酸钠溶液，混匀，以蒸馏水定容至刻度，置于40℃恒温水浴锅中水浴40 min.以相应试剂为空白， 在760 nm 处测定吸光度（ A ） 值.将所测得的吸光度值代入上述回归方程求得其多酚浓度，然后再按下面公式计算乌饭树叶多酚含量.

式中：C为提取液多酚质量浓度，V为提取液体积，f为稀释倍数，m为用于提取的乌饭树叶粉末质量. 1.3.5 Folin-Ciocalteu 比色法方法评价

精密度实验：按上述样品溶液的制备和测定方法对同一待测样品溶液平行测定5 次， 并计算测定结果的相对标准偏差（RSD），以评价该方法的精密度［6］.

稳定性实验：取待测样品溶液1 mL，按1.3.4项下方法在工作液显色完全后在室温下避光放置， 分别在0、0.5、1、1.5、2、4、8 h 进行吸光度测定，计算测定结果的相对标准偏差（RSD），以评价该比色法在一段时间内的稳定性.

重复性实验：准确称取干燥乌饭树叶粉末1.0 g，共5 份，按1.3.3样品溶液的制备方法制备，按1.3.4项下方法测定吸光度，计算样品多酚含量，并计算测定结果的相对标准偏差（RSD），以评价该方法的重复性.

加标回收率实验：精密吸取已知多酚含量的样品溶液5份，每份0.5 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，再加入0.1 mg /mL的没食子酸标准品溶液0.5 mL，测定并计算多酚的回收率及相对标准偏差，以评价该方法的准确性和可靠性.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标，反应液的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1.标准曲线的线性回归方程为y=9.755 7x+0.003 4（其中，x 表示没食子酸质量浓度（mg/mL），y 表示吸光度），相关系数R为0.999 3，表明没食子酸质量浓度在0～0.10 mg/mL范围内与其吸光度呈良好的线性关系，该方程可用于乌饭树叶多酚的定量测定.

图1 没食子酸标准曲线

2.2 比色方法的精密度、重复性和稳定性

由表1可知，精密度实验中，对同一样品溶液进行5次平行测定，测得乌饭树叶中多酚平均含量为79.34 mg/g，相对标准偏差为0.60%，表明该方法具有较高的精密度.重复性实验测得的5个样品中，多酚平均含量为79.69 mg/g，相对标准偏差为1.60 %，表明该方法重复性较好.

表1 精密度和重复性实验结果

稳定性实验结果见表2，吸光值在2 h内变化很小，随着时间的延长，吸光度值略有下降，但下降幅度不大，8 h 内 RSD为0.96 %，表明显色后溶液稳定性良好，能够满足样品分析的要求.

表2 稳定性实验结果

2.3 加标回收率实验

由表3可知，5次加标回收实验的的回收率在101.11%～103.61%之间，平均回收率为102.85%，其相对标准偏差为1.03%，表明该方法准确可靠，可用于乌饭树叶多酚含量的测定.

表3 加标回收实验结果

2.4 乌饭树叶中多酚的含量

精密称取1 g干燥的乌饭树叶粉末3份，按照上述样品溶液的制备和测定方法测定吸光度，计算样品多酚含量.结果测得3份样品中的多酚含量分别为78.62、80.41、79.39 mg/g，平均含量为79.47 mg/g，RSD 为 1.13 %.

3 讨论

目前植物多酚含量测定方法常用的有高锰酸钾滴定法、酒石酸亚铁分光光度法、铁氰化钾分光光度法、Folin-Ciocalteu 比色法、高效液相色谱法等［7］.但由于高锰酸钾滴定法滴定终点较难观察；铁氰化钾分光光度法对测定条件要求严格；高效液相色谱法成本较高等原因，采用较多的方法为酒石酸亚铁比色法和 Folin-Ciocalteu 比色法，但有文献报道酒石酸亚铁比色法测出的数据往往偏高［8-9］，Folin-Ciocalteu比色法测出的数据更接近真实值，目前我国茶叶茶多酚测定的国家标准也是采用Folin-Ciocalteu比色法.因此本试验采用Folin-Ciocalteu比色法测定乌饭树叶中的多酚含量，显色后溶液在8 h内稳定，标准曲线在0～0.10 mg/mL范围内线性关系良好.方法的精密度高，RSD 为 0.60 % ；重现性好，RSD 为 1.60 % ；平均回收率为 102.85 %，RSD为1.03 %；测得乌饭树叶中多酚平均含量为79.47 mg/g.李颖畅［10］等采用Folin-Ciocalteu法测得与乌饭树同属的蓝莓4个品种叶中多酚含量为51.5～9.5 mg/g，其中北陆蓝莓叶中多酚含量与本实验结果较一致.而余清［11］使用酒石酸亚铁比色法测定的乌饭树叶多酚含量为113.6 mg/g，其测定的数据比本研究的数据高出43%，结果的偏差可能主要与测定方法不同有关，同时也与多酚提取方法、乌饭树叶产地等的不同有一定的关系.本研究表明，Folin-Ciocalteu比色法操作简便，精密度及准确度较高， 重复性及稳定性好， 是检测乌饭树叶中多酚的可靠方法.

参考文献：

［1］ 魏振承，张名位.乌饭树属植物资源的营养功能及其开发应用［J］.中国野生植物资源，2001， 20（2）：21-23.

［2］ 陈重明，张宁，王鸣.乌饭树（ Vaccinium bracteatum Thunb. ）的民族植物学［J］.植物资源与环境，1998，7（1）：45-48.

［3］ 尹志娜.植物多酚分离提取方法和生物功能研究进展［J］.生命科学仪器，2010，8（3）：43-49.

［4］ 刘运荣，胡健华.植物多酚的研究进展［J］.武汉工业学院学报，2005，24（4）：63-65，106.

［5］ 周媛，喻玲玲，李新兰，等.苎麻叶中总多酚的含量测定［J］.食品科技，2009，34 （4）：193-197.

［6］ 李文仙，俞丹，林玲，等.Folin-Ciocalteu 比色法应用于蔬菜和水果总多酚含量测定的研究［J］.营养学报，2011，33（3）：302-307.

［7］雷昌贵，陈锦屏，卢大新，等.食品中多酚类化合物的测定方法及其研究进展［J］.食品与发酵工业， 2007，33（1）：100-104.

［8］王烨军，徐奕鼎 ，黄建琴，等.酒石酸亚铁比色法和高锰酸钾滴定法测定茶多酚的比较［J］，茶叶通报，2010，32（2）：61-63.

［9］贾有青，谷晶闫，书婷.茶叶中茶多酚含量的测定方法比较［J］.中国茶叶，2014，36（1）：20-21.

［10］李颖畅，吕艳芳，励建荣.Folin-Ciocalteu 法测定不同品种蓝莓叶中多酚含量［J］.中国食品学报，2014，14（1）：273-278.

［11］余清.乌饭叶多酚提取工艺的研究［J］.福建轻纺，2011（6）：27-31.

（责任编辑：闫文龙）

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1007-5348（2016）02-0037-04

［收稿日期］2015-12-20

［基金项目］2012年度韶关学院科研项目（韶关学院［2012］202号）.

［作者简介］陈瑞娇（1968-），女，广东南雄人，韶关学院英东生命科学学院副教授；研究方向：植物活性成分研究.

Determination of Polyphenols Content in Vaccinium bracteatum Thunb Leaves by Folin-Ciocalteu Colorimetric Method

CHEN Rui-jiao
（ Yingdong College of Biological Sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

Abstract:With gallic acid as the standard， the content of polyphenols in Vaccinium bracteatum Thunb leaves was determined by Folin-Ciocalteu colorimetric method. The results showed that there was a good linearity between concentration of gallic acid and its absorbency in the range of 0～0.10 mg/mL， the regression equation was y=9.755 7x+0.003 4， R=0.999 3. The average recovery rate of the added sample was 102.85%， with relative standard deviation （RSD） of 1.03%. The method is highly precise， reproducible and stable. Thus， this method can be applied to determine the content of polyphenols in Vaccinium bracteatum Thunb leaves. The average content of polyphenols in Vaccinium bracteatum Thunb leaves was 79.47 mg/g （RSD =1.13 %） .

Key words:Folin-Ciocalteu colorimetry；Vaccinium bracteatum Thunb leaves；polyphenols