腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎中的变化及其意义

李春英，邹金海

(河北省沧州市中心医院消化内一科　061001)



腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎中的变化及其意义

李春英，邹金海

(河北省沧州市中心医院消化内一科061001)

[摘要]目的探讨腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎(SBP)中的变化及其意义。方法选取该院肝硬化合并腹水患者174例，根据是否合并SBP将患者分为研究组(合并SBP，88例)和对照组(未合并SBP，86例)。采用流式细胞术检测腹水CD64与外周血mCD14，全部患者均采用头孢他啶联合氧氟沙星抗菌治疗。结果与对照组相比，研究组的外周血白细胞计数[(4.41±1.05) ×109/L]、腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度(16 421.35±289.37)和腹水CD64指数(182.34±16.31)均显著升高(P<0.05)，而淋巴细胞的外周血mCD14阳性表达率[(2.71±0.07)%]、外周血mCD14平均荧光强度(45.62±14.07)、外周血mCD14指数(115.24±24.15)及腹水CD64平均荧光强度(86.47±10.24)则均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与治疗无效/死亡患者相比，治疗有效/生存患者的腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度(574.34±114.01)和腹水CD64指数(52.33±11.25)均显著降低(P<0.05)，而外周血mCD14平均荧光强度(130.11±15.31)、外周血mCD14指数(289.01±30.11)和腹水淋巴细胞CD64平均荧光强度(131.06±20.33)则显著升高，比较差异有统计学意义(P<0.05)；此外，与腹水CD64、外周血mCD14单项检测相比，二者联合检测对治疗效果和预后的预测的准确度显著升高，比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论腹水CD64与外周血mCD14检测可以提示肝硬化是否合并SBP，二者联合检测在对肝硬化合并SBP的诊断和治疗效果判定中有显著的临床意义。

[关键词]腹水；肝硬化；淋巴细胞；CD64；mCD14；自发性细菌性腹膜炎

自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis, SBP)是在非腹腔脏器穿孔和损伤的情况下出现的腹膜急性感染，是一种常发生的临床并发症，常继发于肝硬化失代偿期。SBP的发生可能和机体的免疫力降低、感染机会增多、肠道屏障功能减弱及肠道细菌异位有关。由于缺乏典型的早期临床症状和体征，SBP难以早期诊断和治疗，因而，SBP感染是肝硬化患者死亡的最主要原因之一[1]。在部分细菌感染性疾病中，腹水中性粒细胞CD64分子增高显著，而在系统性红斑狼疮、病毒性感染性疾病、类风湿性关节炎等中变化不明显[2]。外周血mCD14主要分布在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的细胞表面，是一种55×103的糖蛋白(白细胞分化抗原)，在病原菌入侵后机体的免疫反应中发挥至关重要的作用。有研究表明，细菌感染性疾病患者的外周血mCD14表达水平与患者病情程度密切相关，患者病情越严重其外周血mCD14表达水平越低[3]。目前国内外关于肝硬化SBP中腹水CD64、外周血mCD14的临床意义报道较少，本研究旨在通过联合检测肝硬化SBP中腹水CD64、外周血mCD14的表达水平，为肝硬化合并SBP的诊断和治疗提供科学依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取2014年1月至2016年1月本院消化内一科收治的肝硬化合并腹水患者174例。根据临床症状、实验室检查结果明确是否合并SBP，并将患者分为研究组(合并SBP)和对照组(未合并SBP)。研究组88例，其中男68例，女20例；年龄34～68岁，平均(51.34±7.05)岁；肝功能(Child-Pugh)评分(10.28±2.01)分。对照组86例，其中男70例，女16例；年龄34～69岁，平均(50.75±7.14)岁；Child-Pugh评分(10.04±1.49)分。两组患者疾病类型如下。乙型肝炎病毒性肝硬化：研究组24例，对照组24例；丙型肝炎病毒性肝硬化：研究组14例，对照组12例；酒精性肝硬化：研究组10例，对照组12例；乙型/丙型肝炎病毒合并酒精性肝硬化：研究组24例，对照组24例；隐源性肝硬化：研究组4例，对照组4例；胆汁性肝硬化：研究组6例，对照组6例；肝硬化合并肝细胞癌：研究组6例，对照组4例。研究组和对照组间年龄、性别、肝功能分级和疾病类型等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：患者诊断标准参考《肝脏疾病预防与治疗指南》，腹水中性粒细胞计数大于或等于250×106/L。排除标准：完善体格检查、血液细菌培养、胸部X线片、CT等检查结果排除腹腔感染、其他系统感染及近期使用过抗感染药的患者。研究组符合SBP的诊断标准：(1)局部腹膜炎症状表现为腹部压痛、腹痛、腹泻、呕吐和肠梗阻等；(2)发热、畏寒、呼吸急促、外周血白细胞计数异常；(3)肝功能恶化；(4)消化道出血；(5)急进性肾损伤；(6)无明确原因的肝性脑病；(7)休克；(8)腹水细菌培养结果为阳性；(9)腹水中性粒细胞计数大于或等于250×106/L、血清腹水白蛋白梯度(SAAG)≥11 g/L。其中符合(9)可确诊为肝硬化合并SBP。对照组排除SBP的诊断标准。

1.2方法

1.2.1检测方法(1)试剂与仪器：同型免疫球蛋白、溶血素和红细胞裂解液由上海生工生物工程有限公司提供；CD64抗体试剂盒和异硫氰酸荧光素标记性MCD14单克隆抗体均购自美国CST公司；CANTO-Ⅱ流式细胞仪购自美国BD公司；Eppendorf 5810R高速冰冻离心机、System XT-2000i血常规仪、Stago-Compact 血凝功能分析仪、HITACHI7600型全自动生化分析仪、Cobase411电化学发光仪。(2)标本采集方法：采集所有受试者在应用抗感染药物前的清晨空腹外周血，进行血常规、凝血功能、肝功能和肾功能等检查。腹水检测包括腹水常规和细菌培养，无菌条件下行腹腔穿刺术，抽取腹水10～15 mL，送检至常规细菌培养或其他检测，标本于-70 ℃冰箱保存。(3)腹水CD64检测和外周血mCD14检测采用流式细胞术。腹水CD64检测方法：取上述采集的患者腹水适量经离心、过滤、腹水CD64抗体孵育染色、红细胞裂解液溶血及洗涤后，采用流式细胞仪测定腹水CD64平均荧光强度。外周血mCD14检测方法：取上述采集的患者外周全血适量经与外周血mCD14抗体孵育、红细胞溶解、离心、PBS缓冲液清洗等一系列操作后，采用流式细胞仪检测、观察外周血mCD14阳性表达率及其外周血mCD14平均荧光强度，采用同型免疫球蛋白对照。

1.2.2观察指标研究组均给予头孢他啶联合氧氟沙星抗菌药物治疗1周，1周后对治疗效果进行评估。疗效评估标准[4]如下。(1)有效：腹水细菌培养为阴性，腹水中性粒细胞计数小于250×108/L，炎症性症状得到缓解；(2)无效：腹水细菌培养为阳性，腹水中性粒细胞计数大于或等于250×108/L，炎症性症状无改善甚至恶化。此外，对治疗有效和治疗无效患者的生存和死亡、腹水CD64及外周血mCD14进行分析比较，并用受试者工作特征曲线(ROC曲线)测试腹水CD64与外周血mCD14单独检测及二者联合检测对治疗效果和预后的预测价值。腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度、腹水淋巴细胞CD64平均荧光强度和外周血mCD14平均荧光强度的正常参考范围分别为：<5 000、>100、>80。腹水CD64指数=腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度/腹水淋巴细胞CD64平均荧光强度；外周血mCD14指数=外周血mCD14阳性表达率×外周血mCD14平均荧光强度×外周血白细胞计数/10 000。

2结果

2.1两组腹水CD64比较174例患者的腹水CD64的检测结果显示，研究组腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度和腹水CD64指数均明显高于对照组(P<0.05);而淋巴细胞CD64平均荧光强度则显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1　两组患者腹水CD64比较

2.2两组外周血mCD14比较研究组外周血mCD14阳性表达率、外周血mCD14平均荧光强度和mCD14指数显著低于对照组(P<0.05)，而外周血白细胞计数则明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2　两组外周血mCD14比较

2.3治疗有效和无效患者腹水CD64、外周血mCD14比较研究组中治疗有效患者60例，治疗无效患者28例，经检验，两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗有效患者的腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度和腹水CD64指数均显著低于治疗无效患者(P<0.05)，而外周血mCD14指数、外周血mCD14平均荧光强度和腹水淋巴细胞CD64平均荧光强度则明显高于治疗无效患者(P<0.05)，见表3。

2.4生存和死亡患者腹水CD64、外周血mCD14比较研究组随访6个月，共随访86例，随访率为97.73%，其中生存54例，死亡32例。经检验，两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。生存患者的腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度和腹水CD64指数显著低于死亡患者(P<0.05)，而生存患者的外周血mCD14指数、腹水CD64平均荧光强度和外周血mCD14平均荧光强度则显著高于死亡患者(P<0.05)，见表4。

2.5腹水CD64与外周血mCD14联合检测对治疗效果和预后的预测价值ROC曲线显示，腹水CD64和外周血mCD14单项检测均对治疗效果和预后的状况有重要的预测作用，但二者联合检测较单独腹水CD64、外周血mCD14检测更准确，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1～2、表5。

表3　治疗有效和无效患者腹水CD64、外周血mCD14比较

表4　生存和死亡患者腹水CD64、外周血mCD14比较

表5　腹水CD64与外周血mCD14联合检测对治疗效果和预后状况的预测价值

a：P<0.05，与腹水CD64、外周血mCD14指数联合比较。

图1　腹水CD64、外周血mCD14指数对治疗效果的ROC曲线

图2　腹水CD64、外周血mCD14指数对预后状况的ROC曲线

3讨论

由于晚期肝硬化患者的免疫力明显降低，在临床上约20%的肝硬化患者容易形成SBP。外周血白细胞计数在肝硬化合并细菌性感染性疾病患者中减少，但在肝硬化合并其他疾病患者中同样会降低[5]，因此用白细胞计数诊断肝硬化合并SBP的准确度较低。此外，外周血中性粒细胞比例、外周血白细胞、血清C反应蛋白、红细胞沉降率和降钙素原等是临床上诊断细菌感染的常用指标，但其在肿瘤转移浸润、外科术后等其他状况下也会发生显著变化[6]，因此特异性较差。细菌感染的金标准是腹水细菌培养，但其有历时长和灵敏度低等局限。CD64是免疫球蛋白超家族成员之一，是免疫球蛋白G(IgG)的Fc受体，主要分布于巨噬细胞和单核细胞表面、中性粒细胞中表达水平较低。中性粒细胞CD64分子在机体受到病原菌入侵等应激性作用下会迅速升高，因此，可作为细菌感染性疾病早期诊断的依据[7]。在重症感染性疾病的发生和发展中，单核细胞发挥重要作用。有研究称，重症胰腺炎外周血mCD14指数、外周血mCD14阳性表达率和外周血mCD14平均荧光强度显著低于阴性对照组，上述指标在存活患者中呈逐渐升高趋势，而在死亡患者中的表达水平较低，这提示外周血mCD14低水平表达提示患者预后欠佳[8]。外周血mCD14阳性表达率呈降低倾向时处于免疫抑制，预后欠佳。有研究者在重症感染患者住院24 h内对患者进行外周血mCD14测定，其结果显示患者外周血mCD14表达水平显著高于健康人群，这可能是由于短期内免疫亢进现象引起的。炎症免疫亢进现象消失后，患者的外周血mCD14平均荧光强度显著低于健康人群[9]。但关于腹水CD64和外周血mCD14在肝硬化SBP中的变化及其临床意义研究罕见。

本研究结果显示，研究组的外周血白细胞计数和腹水中性粒细胞CD64平均荧光强度明显增高，而腹水淋巴细胞CD64平均荧光强度明显降低，结合本研究结果，研究组腹水CD64指数显著增高，与相关报道一致[10]。同时，与对照组相比，研究组外周血mCD14阳性表达率和外周血mCD14平均荧光强度均明显降低，因此，研究组外周血mCD14指数显著降低，外周血mCD14指数反映每单位外周血mCD14相对总数，提示肝硬化合并SBP患者处于免疫抑制状态。另一方面，本研究发现治疗有效患者的腹水CD64指数显著降低，外周血mCD14指数显著增高，联合检测患者腹水CD64和

外周血mCD14指数对治疗效果的预测价值显著优于单独腹水CD64、外周血mCD14指数检测；与死亡患者相比，生存患者的腹水CD64指数明显降低，其外周血mCD14指数则明显升高，联合检测腹水CD64和外周血mCD14指数对患者预后的判定价值明显优于单独腹水CD64、外周血mCD14指数检测；二者联合参数较单独腹水CD64、外周血mCD14参数更准确。现今尚无有效指标预测治疗效果和预后状况，结合该研究结果揭示，腹水CD64在肝硬化合并SBP中显著增高，外周血mCD14在肝硬化合并SBP中显著降低，二者均对治疗效果和预后状况具有重要的预测作用。

但目前仍缺乏对外周血mCD14表达的标准方法。由于实验室处理样本方法及其规范不同，采用的流式细胞仪与抗体均具有明显差异，可能影响检测结果。本研究采用平均荧光强度用于反映外周血单核细胞膜表面mCD14水平，容易受检测过程的影响。因此，需要标准化方法用于定量测定外周血单核细胞膜表面mCD14水平，以增加外周血mCD14对肝硬化合并SBP预测价值的可信度。

综上所述，腹水CD64与外周血mCD14检测可以作为肝硬化是否合并SBP的判断依据，二者联合检测在对硬化合并SBP的诊断和治疗效果判定中有显著的临床意义。

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作者简介：李春英(1976-)，副主任医师，硕士，主要从事胃肠、肝胆胰腺疾病的诊断治疗研究。

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.017

[中图分类号]R657.31

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)15-2084-03

(收稿日期：2015-11-29修回日期：2016-02-22)

The change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 combined detection for hepatocirrhosis with SBP

Li Chunying，Zou Jinhai

(theFirstDigestionDepartment，CangzhouCentralHospitalofHebeiProvince,Cangzhou,Hebei061001)

[Abstract]ObjectiveTo study the change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 combined detection for hepatocirrhosis with SBP.MethodsA total of 174 cases hepatocirrhosis with ascites were selected and divided into research group (combined SBP, 88 cases) and control group (none SBP,86 cases).Ascites CD64 and peripheral blood mCD14 were detected by flow cytometry. All patients were treated with ceftazidime and ofloxacin.Resultsneutrophil CD64 average fluorescence intensity(1 642.35±289.3),CD64 index(182.34±16.31) and peripheral blood leukocyte count[(4.41±1.05)×109/L] of research group were significantly higher than those of control group(P<0.05);lymphocyte CD64 average fluorescence intensity(86.47±10.24),mCD14 positive expression rate[(2.71±0.07)%],monocyte mCD14 average fluorescence intensity(45.62±14.07) and mCD14 index(115.24±24.15) were significantly lower than those of control group (P<0.05).CD64 average fluorescence intensity(574.34±114.01) and neutrophil CD64 index(52.33±11.25) of effective treatment/survival group were significantly lower than those of ineffective treatment/death group;lymphocyte CD64 average fluorescence intensity(131.06±20.33),monocyte mCD14 average fluorescence intensity(130.11±15.31) and mCD14 index(289.01±30.11) of effective treatment/survival group were significantly higher than those of ineffective treatment/death group(P<0.05).The area under the ROC curve,critical value,sensitivity and speciality rate of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection for therapeutic effect and prognosis prediction were significantly higher than those of CD64,mCD14 single detection(P<0.05).ConclusionAscites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection predicts therapeutic effect and prognosis for hepatocirrhosis with SBP significantly.

[Key words]ascites；liver cirrhosis；lymphocytes；CD64；mCD14；spontaneous bacterial peritonitis