H PLC测定不同产地酒黄精中5-羟甲基糠醛含量

郭婕王英姿孙秀梅张兆旺（山东省疾病预防控制中心，山东 济南5004；北京中医药大学中药学院，北京000；山东中医药大学，济南5004）



H PLC测定不同产地酒黄精中5-羟甲基糠醛含量

郭婕1王英姿2孙秀梅3张兆旺3
（1山东省疾病预防控制中心，山东 济南250014；2北京中医药大学中药学院，北京100102；3山东中医药大学，济南250014）

【摘要】目的：比较不同产地酒黄精中5-羟甲基糠醛的含量。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱：Phenomenex-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.05%磷酸水（5∶95）；流速1.0 mL/min；检测波长284 nm；进样量20 μL；线性范围：2.016～40.32 μg/mL（r=0.999 9）。结果：云南版纳、云南云龙、云南思茅、云南文山、贵州石阡、贵州安顺、贵州遵义、湖南沅陵、湖南怀化、安徽宣城等地酒黄精5-羟甲基糠醛含量分别为：2.127，2.244，2.076，2.312，1.975，1.951，1.930，1.845，1.878，1.649 mg/g。结论：不同产地黄精中5-羟甲基糠醛的含量差异明显，其中以云南文山产酒黄精中5-羟甲基糠醛的含量最高。

【关键词】产地；酒黄精；5-羟甲基糠醛；高效液相色谱法；含量测定

黄精为百合科植物滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）、黄精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根茎，有补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效［1］。既是药品又是食品。因其生品有刺激咽喉的不良反应，故需经炮制后供使用。黄精经酒制后，不仅可以消除刺激性，而且能增强补益疗效。现代药理研究发现黄精有明显的提高免疫系统功能、抗疲劳、抗衰老、降血糖、降血脂等药理作用［2-4］。实验研究发现酒制后黄精中5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量增加明显，王永禄及曾林燕等对炮制过程中5-HMF含量改变进行探讨［5-6］。5-HMF在医药领域作为有效成分制备抗心肌缺血的心血管病药品，已被中国药科大学作为专利进行申请（申请专利号：CN97107191.8，公开号：CN1182589），这与现代研究中酒黄精对心血管的作用是相一致的。治疗心律失常的步长稳心颗粒，其配方也是以黄精为主要原料制配而成［7］。多年来5-HMF的药理作用研究取得了一定的进展，但仍存在一定的争议，没有公认的结论［8］。之前有研究认为，5-HMF有一定的毒副作用，对眼睛、黏膜、皮肤有刺激性，能与人体蛋白质结合后引起中毒，造成横纹肌麻痹和内脏损害，并且具有神经毒性，且存在潜在的遗传及生殖毒性，有不少中药品种也制定了有关5-HMF的含量测定方法［9］。近年来，对于5-HMF的药理作用出现一些新的研究，发现它有很多对人体有益的积极作用，5-HMF是一种能有效防治神经退行性疾病、认知损害和抗心肌缺血的心血管病药物，它很有可能是被人们忽视的存在于单味中药及复方背后的一种活性成分［10］。本实验以不同产地酒黄精为研究对象，对5-HMF的含量进行比较。

1　实验仪器与材料

DYQ420型参茸切片粉碎双用机（浙江省瑞安市环球药械厂）；KQ-250E型医用超声波清洗器（江苏昆山超声仪器公司）；FA-1104型电子天平（上海精密仪器厂）；AE 240型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；LDZ4-0.8北京医用离心机；LC-10AT高效液相色谱仪（日本·岛津）；SPD-10A检测器；N2000色谱工作站。

黄精药材经专家鉴定为百合科植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎。取黄精药材100 g，洗净，加入黄酒 20 kg，水20 kg，润 1 h，蒸 7 h，闷3 h。取出，80℃烘至药材不粘手，切厚片（3 mm），80℃干燥，即得。闷润后蒸制为黑褐色饮片，显黏性，味甜。粉碎成粗粉（过《中国药典》2号筛），备用。

5-HMF（中国食品药品检定研究院，批号：111626-200301），黄酒（安徽海神黄酒有限公司酿造）。甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2　方法和结果

2.1样品的制备

分别取云南、贵州、湖南、安徽产黄精洗净，按确定的中试工艺制备酒黄精，共10批，其中云南4批，贵州3批，湖南2批，安徽1批。本品为黑褐色饮片，显黏性。味甜。粉碎成粗粉（过《中国药典》2号筛），备用。

2.2酒黄精的含水量测定

取“2.1”项下样品，按《中国药典》2010年版一部附录53页水分测定法中甲苯法测定，测定结果见表1。

表1　含水量测定结果

2.3酒黄精的5-HMF含量测定

2.3.1供试液的制备分别取“2.1”项下样品各0.4 g，精密称定，加甲醇15 mL，超声提取20 min，滤过，滤渣加甲醇 10 mL，超声提取 10 min，滤过，滤液依次定容至25 mL，制得供试液F1～10（每1 mL相当于药材约0.016 g），备用。

2.3.2对照液的制备取 5-HMF对照品 10 mg，精密称定。用甲醇溶解定容至2 mL，备用。

2.3.3色谱条件色谱柱：Phenomenex-C18（150 mm× 4.60 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸水（5:95）；流速1.0 mL/min；检测波长284 nm；进样量20 μL；采用保留时间定性；分析方法：外标两点法。

2.3.4标准曲线的绘制精密量取“2.3.2”项下的对照液，分别稀释，得到7个不同浓度的对照液，分别取 20 μL进样，按“2.3.3”项下色谱条件，依法测定。结果见表2。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，见图2。回归方程为：y=50 180x＋ 8 307.2（r=0.999 9），线性范围：2.016～ 40.32 μg/mL。

图1　5-HMF高效液相图谱

表2　5-HMF高效液相吸收曲线测定结果

图2　5-HMF高效液相标准曲线

2.3.5精密度试验精密移取“2.3.4”项下对照液（25.20 μg/mL）20 μL，按“2.3.3”项下色谱条件，依法测定。连续测定5次，RSD为0.47%，表明精密度良好，见表3。

表3　精密度试验结果

2.3.6重现性试验精密移取“2.1”项下样品（湖南沅陵），按“2.3.1”项下条件制备供试液5份，按“2.3.3”项下色谱条件，依法测定。连续测定5次，RSD为0.71%，表明该测定方法重现性好（表4）。2.3.7稳定性试验精密移取“2.3.4”项下对照液（25.20 μg/mL）20 μL，按“2.3.3”项下色谱条件，每隔24 h依法测定1次，连续5天，RSD为1.65%，表明5天内稳定性良好（表5）。

表4　重现性试验结果

表5　稳定性测定结果

2.3.8样品的5-HMF含量测定取“2.3.1”项下供试液 F1～10，稀释至适宜浓度，精密移取 20 μL，按“2.3.3”项下色谱条件，依法测定。计算各样品中5-HMF含量。结果见表6。

表6　5-HMF含量测定结果

2.3.9回收率考察精密移取“2.3.1”项下供试液F8共 5份，每份 10 μL，分别加入“2.3.4”项下对照液10 μL，按“2.3.3”项下色谱条件，依法测定，计算回收率。结果见表7。

表7　5-HMF回收率考察结果

3　讨论

传统中药材讲究道地药材，道地药材是指在一特定自然条件、生态环境的地域内所产的药材，因生产较为集中，栽培技术、采收加工也都有一定的讲究，以致较同种药材在其他地区所产者品质佳、疗效好。道地，也就是地道，也即功效地道实在，确切可靠。古代本草有关道地药材的论述从东汉《神农本草经》开始，历代本草对药材产地和疗效的关系均有记载，而明确道地产区的最早文献是明代的《本草品汇精要》。该书记载植物药916种，明确道地优劣的有2种。

我国有黄精30余种，分布广泛，《中国药典》2010年版［11］仅对黄精中的黄精多糖进行了限量规定，虽然多糖类有一定的免疫调节及抗肿瘤作用［12］，但不能全面反映酒黄精的质量。黄洪新等［13］对河南，河北，山西产地的生黄精进行了 5-HMF含量测定，以河北产地的为高；曾林燕等［6］以液相色谱-质谱联用（LC-MS）法对黄精，滇黄精和多花黄精的生品进行5-HMF含量测定，认为其不存在于生品中，但未注明生品的明确加工过程和技术参数（如干燥时间及干燥温度）［6］；常亮等［14］对黄精，滇黄精和多花黄精的生品进行5-HMF含量测定，发现不同黄精生品含有的5-HMF量不同，但都很微量。本研究认为5-HMF不是生黄精的主要药效成分，在生黄精的质量标准研究中可忽略或较少考虑此成分的测定。黄精酒制过程加热时间长，温度较高，含有大量的糖类成分，炮制过程中可能产生还原糖类成分与氨基酸类成分的美拉德反应，不可避免会产生5-HMF等反应产物，5-HMF作为酒黄精中主要活性成分之一，有必要对其含量进行控制。

本研究结果表明各地酒黄精中5-HMF含量差别明显，其含量从低到高依次为安徽宣城、湖南沅陵、湖南怀化、贵州遵义、贵州安顺、贵州石阡、云南思茅、云南版纳、云南云龙、云南文山，以云南产为高。测定不同产地酒黄精中5-HMF的含量可为研究黄精产地对酒黄精质量的影响及酒黄精的质量标准制定奠定基础。

参考文献：

［1］ 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草精选本［M］.上海科学技术出版社，1998：2069-2076.

［2］ 夏晓凯，张庭廷，陈传平.黄精多糖的体外抗氧化作用研究［J］.湖南中医杂志，2006，22（4）：90，96.

［3］ 文珠，肖移生，唐宁，等.黄精多糖对神经细胞的毒性及抗缺氧性坏死和凋亡作用研究［J］.中药药理与临床，2006，22（2）：29-31.

［4］ 郭婕，颜燕，姚文环，等.铁皮石斛茶缓解小鼠体力疲劳作用的研究［J］.海峡药学，2015，27（2）：19-21.

［5］ 王永禄，王丽瑶，朱欣佚，等.常压蒸制和高压蒸制对酒黄精化学成分的影响研究［J］.中国生化药物杂志，2014，34（8）：173-175.

［6］ 曾林燕，宋志前，魏征，等.黄精炮制过程中新产生成分分离及含量变化［J］.中草药，2013，44（12）：1584-1588.

［7］ 桑小军，李淑芳.步长稳心颗粒治疗心律失常作用及临床进展［J］.内蒙古中医药，2013，32（24）：137.

［8］ 耿放，王喜军.5-羟甲基糠醛在中药复方中的研究现状及相关药效探讨［J］.世界科学技术一中医药现代化，2005，7（6）：52-56.

［9］ 吴毅，许妍，赵雯，等.参麦注射液中5-羟甲基糠醛的含量测定［J］.齐鲁药事，2012，31（1）：11-12.

［10］ 刘月新，潘雪，邹茜，等.探讨5-羟甲基糠醛在中药及复方中的存在意义［J］.中国现代药物应用，2013，7（15）：3-5.

［11］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：288.

［12］ 杨海，耿传信，周学锋.灰树花活性多糖药理研究综述［J］.中国执业药师，2012，9（3）：30-33.

［13］ 黄洪新，徐道华，刘俊臣，等.地黄炮制前后5-羟甲基糠醛含量的研究［J］.时珍国医国药，2012，23（4）：938-939.

［14］ 常亮，陈珍珍，王栋，等.HPLC和 GC-MS法测定三种黄精炮制过程中5-羟甲基糠醛的含量［J］.中国药师，2015，18（3）：387-390.

doi：10.3969/j.issn.1672-5433.2016.02.007

收稿日期：（2015-09-11）

作者简介：郭婕，女，硕士，主管药师。主要从事食品药品等健康相关产品的研究。通讯作者E-mail：gjsd2008@126.com

Determination of 5-Hydroxymethyl Furfural Content in Alcoholis Rhizoma Polygonat from Different Places of Production by HPLC

Guo jie1，Wang Yingzi2，Sun Xiumei3，Zhang Zhaowang3
（1 Shandong Center for Disease Control and Prevention，Shandong Jinan 250014，China；2 School of Chinese Pharmacy of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102；3 Shandong University of Chinese Medicine，Jinan 250014）

ABSTRACTObjective:To compare the content of 5-hydroxymethyl furfural（HMF）in Alcoholis Rhizoma Polygonat derived from different places of production.Methods:High performance liquid chromatography（HPLC）was adopted. The Phenomenex-C18column（150 mm×4.60 mm，5 μm）was used，serving methanol-0.05%phosphoric acid solution （5∶95）as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 284 nm，while the sample loading was 20 μL.The linear range of 5-HMF was 2.016～40.32 μg/mL（r=0.999 9）.Results:The content of 5-HMF in Alcoholis Rhizoma Polygonat from Banna Yunnan，Yunlong Yunan，Simao Yunan，Wenshan Yunan，Shiqian Guizhou，Anshun Guizhou，Zunyi Guizhou，Yuanling Hunan，Huaihua Hunan and Xuancheng Anhui were 2.127，2.244，2.076，2.312，1.975，1.951，1.930，1.845，1.878 and 1.649 mg/g，respectively.Conclusion:The contents of 5-HMF in Alcoholis Rhizoma Polygonat from different places of productionn are significantly different，in which one from Wenshan Yunnan is the highest.

KEY WORDSPlace of Production；Origin；Alcoholis Rhizoma Polygonat；5-Hydroxymethyl Furfural（HMF）；HPLC；Content Determination