利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

徐彦召，王　青，胡建和，余　娟，陈仕均

(河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡 453003)



利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

徐彦召，王青，胡建和，余娟，陈仕均

(河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡 453003)

[摘要]【目的】 建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】 根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征，对pBluescprict Ⅱ SK(+)载体进行多克隆序列改造；设计特异性引物，分6段扩增、组装出PRRSV的全长cDNA并扩增CMV真核启动子序列；采用酶切、连接、转化等方法将连接成功病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游，获得含有CMV启动子和猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CH-1A；再将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒。【结果】 成功获得了19 112 bp含CH-1A全长cDNA的pSK-CH-1A载体，将其直接转染MARC-145宿主细胞后，经细胞体内转录合成病毒基因组RNA，获得了拯救病毒(rCH-1A)；病毒生长特性试验结果显示，拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性，且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记MluⅠ酶切位点。【结论】 建立了一种方法简单，操作方便，节约时间和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的体外拯救方法。

[关键词]猪繁殖与呼吸综合征病毒；CMV启动子；感染性克隆

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是目前危害世界养猪业的重要传染病病原之一，该病毒属于套式病毒目(Nidovirale)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)。研究者通过对PRRSV全基因组序列分析，将其分成2种基因型，即欧洲型(genotype Ⅰ)和美洲型(genotypeⅡ)，我国的流行毒株(包括高致病性PRRSV)为美洲型[1-2]。这2种基因型PRRSV都能够引起以母猪的繁殖障碍(如：流产、早产和死胎等)和各年龄段猪的呼吸道症状为主要特征的临床疾病。2006年，我国南方猪群中暴发了以发病急、传播快、高发病率和死亡率等为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综 合征(High pathogenic PRRS，HP-PRRS)，使得PRRSV成为近年来研究的热点[3-5]。PRRSV基因组结构与同属的其他动脉炎病毒类似，属于单股正链RNA病毒，基因组依次为5′-(cap)UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2-7-UTR-poly(A)-3′[6-7]。

科研工作者要进行病毒(尤其是RNA病毒)基因组结构和功能、病毒与宿主的相互关系、病毒毒力增强机制等方面的研究，首先需要构建该病毒反向遗传学操作平台，即得到该病毒的感染性全长cDNA克隆。在PRRSV感染性克隆构建过程中，早期研究主要采取将含有PRRSV基因组全长cDNA的克隆置于原核转录启动子(如：噬菌体T7、SP6启动子)下建立病毒的拯救体系，这样的设计在操作上存在很多局限性[8-12]。为此，本试验将PPRSV基因组全长cDNA置于真核启动子CMV下，构建了重组质粒pSK-CH-1A，将其直接转染MARC-145细胞，通过宿主细胞自身的转录酶系统在细胞内转录出PRRSV全基因组RNA，进而翻译出病毒所需的全部蛋白，最终拯救出病毒，以期缩短病毒拯救的时间，同时降低病毒拯救的成本。

1材料与方法

1.1材料

病毒株、细胞及载体：PRRSV CH-1A毒株、MARC-145细胞、pBluescriptⅡSK(+)和pEGFP-C3真核表达载体以及大肠杆菌DH5α，均由河南科技学院预防兽医学实验室保存。

主要试剂：RNA提取试剂盒为QIAGEN公司(美国)产品；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；PfuUltraⅡ Fusion HS DNA Polymerase购自Stratagene公司(美国)；SupersciptⅢ逆转录酶、抗鼠荧光抗体和脂质体2000转染试剂为Invitrogen公司(美国)产品；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶PacⅠ和SbfⅠ、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、rTaq酶、dNTP、DL-2000 DNA Marker和DL-15000 DNA Marker均为TaKaRa公司(中国)产品；胎牛血清、高糖的DMEM培养基为GIBCO公司(美国)产品；抗PRRSV N 蛋白抗体为IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒中阳性对照样品，其他化学试剂均为国产分析纯级。

1.2pBluescript Ⅱ SK(+)载体的改造

运用分子生物学软件DNAstar对GenBank中PRRSV CH-1A株全基因组序列(GenBank登录号：AY032626)和CMV真核启动子序列(GenBank登录号：U57607)进行分析，对pBluescriptⅡ SK(+)的多克隆位点区(MCS)进行改造，改造后的MCS中酶切位点的顺序为XhoⅠ-PacⅠ-CMV-SbfⅠ-AfeⅠ-AflⅡ-NheⅠ-AscⅠ-MluⅠ-SwaⅠ-NotⅠ。将改造好的载体送上海生工生物工程有限公司进行测序分析，阳性载体命名为pSK-MSC。

1.3CMV真核启动子序列的克隆及pSK-CMV载体的构建

取上述PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，并纯化回收。将回收后的CMV启动子序列和pSK-MSC载体分别用限制性内切酶PacⅠ和SbfⅠ进行双酶切，分别回收目的片段，然后将二者用T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌感受肽DH5α，挑取单菌落，送往上海生工生物工程有限公司进行测序验证。将鉴定正确的质粒命名为pSK-CMV。

1.4PRRSV全基因组序列引物设计与合成

为了获得根据CH-1A株PRRSV全基因组cDNA序列，本研究根据GenBank中PRRSV全基因组序列，用Primer 5.0软件设计了6对涵盖PRRSV全基因组序列(片段A-F)的引物，均由上海英骏生物工程公司合成，引物序列见表1。

表 1　CH-1A株PRRSV全基因组cDNA片段扩增引物Table 1　Oligonucleotide primers used to amplify whole genome cDNA of PRRSV

注：引物Ch-1-UP和Ch-6-DP下划线标记的序列分别为SbfⅠ、SwaⅠ和NotⅠ酶切位点序列；引物Ch-5-DP和Ch-6-UP方框中的碱基为突变后产生MluⅠ酶切位点的碱基，下划线标记的序列为突变后产生的MluⅠ酶切位点序列。

Note：The underlined sequences Ch-1-UP and Ch-6-DP are cleavage sites ofSbfⅠ,SwaⅠ,andNotⅠ.The underlined sequences Ch-5-DP and Ch-6-UP are cleavage sites ofMluⅠ,mutant sites are shown in box.

1.5PRRSV CH-1A株全长cDNA克隆

1.5.1cDNA分段扩增将CH-1A株接种于MARC-145细胞，待80% MARC-145细胞发生病变致脱落时，收获细胞及细胞培养液，并将其冻融3次后，12 000 r/min 离心3 min，去除细胞碎片，取上清液备用。按照RNA提取试剂盒操作说明书提取上清液中CH-1A株总RNA。

参照Superscipt Ⅲ逆转录酶产品说明书，以每个片段下游引物(表1)为反转录引物，合成第一链cDNA。PCR扩增参照Pfu DNA聚合酶产品说明进行。每个PCR反应体系为50 μL，其中包括10×pfx扩增缓冲液5 μL，10 mmol/L dNTP混合物1.5 μL，50 mmol/L MgSO41 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，cDNA 2 μL，补充灭菌水至50 μL。反应条件为:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，退火(退火温度见表1) 30 s，72 ℃ 2.5 min，循环30次；最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5.2全长cDNA连接将1.5.1节扩增得到的各片段PCR产物按胶回收试剂盒操作说明进行纯化，按图1所示的酶切位点进行酶切，先分别连入pSK-CMV载体，得到的重组质粒命名为pSK-A(B/C/D/E/F)，再按图1所示流程将各个片段通过相应的酶切位点逐一连接，最终获得含有PRRSV CH-1A株全长基因组cDNA的pSK-CH-1A质粒。全长cDNA组装过程中所用的连接酶均为T4 DNA连接酶，16 ℃过夜连接。连接产物均转化E.coliDH5α细胞，挑取单克隆，摇菌并提取质粒DNA，进行PacⅠ和NheⅠ双酶切以及MluⅠ单酶切，产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。将酶切后与预期长度相符泳带对应的质粒送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.6拯救病毒 rCH-1A的构建与体外传代

采用去内毒素的质粒提取试剂盒提取含有PRRSV CH-1A株全长基因组序列的pSK-CH-1A载体，根据脂质体2000转染试剂说明书，在MARC-145细胞融合度为70%～80%时进行转染操作。在转染后约60 h收取转染细胞，冻融3次，12 000 r/min 离心2 min，去除细胞碎片，上清液即为获得拯救病毒(rCH-1A)的病毒液。

将rCH-1A病毒液接种于MARC-145细胞传代，具体操作如下：在感染前一天，将状态良好的MARC-145细胞接种于细胞瓶中，待细胞融合度达到80%～90%(约需12 h)进行病毒的接种传代。将第2代拯救病毒rCH-1A接种到MARC-145细胞，每天观察细胞病变(CPE)情况，试验同时设感染亲本病毒CH-1A和空白的MARC-145细胞为对照。

图 1　PRRSV CH-1A株基因组全长cDNA的组装Fig.1　Assembly of the full-length cDNA clone of PRRSV strain CH-1A

1.7拯救病毒rCH-1A的鉴定

1.7.1拯救病毒分子标记的检测为了区别拯救病毒rCH-1A和亲本病毒CH-1A，在克隆CH-1A株PRRSV cDNA时，通过基因同义突变的方式在其基因组序列中引入了新的MluⅠ酶切位点，故可据此来鉴别rCH-1A和CH-1A。取3代拯救病毒rCH-1A，提取其RNA，以之为模板，对突变的MluⅠ 酶切位点周围序列进行RT-PCR扩增(引物F14436:5′-GCGTTTTCCATTACCTATAC-3′和R14868:5′-CCTGTTTAACAGCTTTTCTG-3′，由上海英骏生物工程公司合成)。RT-PCR反应的体系和程序参见1.5.1节进行。回收RT-PCR扩增产物进行MluⅠ酶切，取10 μL酶切反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。试验同时设亲本病毒CH-1A作为阳性对照，空白的MARC-145细胞作为阴性对照。

1.7.2拯救病毒rCH-1A的间接免疫荧光检测将拯救病毒rCH-1A接种到铺满单层的MARC-145 细胞，按常规步骤进行间接免疫荧光试验(IFA)检测。IFA检测用PRRSV N蛋白抗体进行鉴别。试验同时设亲本病毒CH-1A作为阳性对照，空白的MARC-145细胞作为阴性对照。

1.7.3拯救病毒rCH-1A半数细胞感染量(TCID50)测定拯救病毒TCID50采用96孔组织培养板法测定。将拯救病毒rCH-1A接种MARC-145细胞，每隔12 h观察感染病毒后的细胞生长状态，并记录培养板中出现CPE的孔数，感染病毒细胞停止出现CPE时即终止观察。病毒TCID50的测定结果按Reed-Muench法[9]计算。同时检测亲本病毒CH-1A的TCID50。

1.7.4拯救病毒rCH-1A多步生长曲线测定以100×TCID50病毒感染剂量,将第5代rCH-1A感染MARC-145细胞，并在病毒感染后的不同时间点12，24，36，48，60，72，84和96 h收集300 μL细胞上清液进行病毒滴度测定。病毒滴度参考缺失拯救病毒细胞的半数细胞感染量(TCID50)测定。最后以感染后时间为横坐标，以该时间测得病毒TCID50为纵坐标绘制出该病毒的多步生长曲线。同时测定其亲本病毒CH-1A的多步生长曲线，比较拯救病毒与其亲本病毒在MARC-145细胞上的生长特性差异。

2结果与分析

2.1pBluescript Ⅱ SK(+)载体的改造及pSK-CMV载体的鉴定

对改造后的pBluescriptⅡ SK(+)载体进行测序，与预期结果一致，图2为改造后多克隆位点的测序结果。克隆出CMV启动子序列，将其和pSK-MSC连接，测序验证正确，将其命名为pSK-CMV。

图 2　pSK-MSC多克隆位点的测序结果Fig.2　Sequencing of multiple cloning sites of pSK-MSC plasmid

2.2PRRSV CH-1A株全基因组分段扩增

PRRSV CH-1A株全基因组的分段扩增结果见图3。由图3可知，经RT-PCR扩增，获得了PRRSV CH-1A株全基因组6个片段，各片段长度分别为2 227 bp(片段A)、4 549 bp(片段B)、1 242 bp(片段C)、4 363 bp(片段D)、2 853 bp(片段E)和674 bp(片段F)，均与预期结果相符。

2.3PRRSV CH-1A株全长cDNA的组装

对pSK-CH-1A质粒进行限制性内切酶PacⅠ和NheⅠ双酶切鉴定以及MluⅠ单酶切鉴定，结果双酶切获得了8 521 bp和10 691 bp的片段，单酶切获得了19 112 bp的片段(图4)，说明成功构建了PRRSV CH-1A株全长cDNA克隆，且该cDNA克隆具有突变的MluⅠ酶切位点。

图 3　PRRSV CH-1A株全基因组的分段扩增结果 M.DNA Marker;1～6.分别代表病毒基因组片段A～FFig.3　Segmented amplification of PRRSV genome of CH-1A strain M.DNA Marker;1-6.Represent virus genome segment A-F,respectively 图 4　pSK-CH-1A质粒酶切鉴定结果 M.DNA Marker;1.pSK-CH-1A质粒PacⅠ和 NheⅠ双酶切 结果；2.pSK-CH-1A质粒的MluⅠ单酶切结果Fig.4　Restriction enzyme digestion results of recombinant plasmid pSK-CH-1A M.DNA Marker;1.pSK-CH-1A plasmid double digested by PacⅠandNheⅠ;2.pSK-CH-1A plasmid digested by MluⅠ

2.4拯救病毒rCH-1A致细胞病变能力的检测

将第2代拯救病毒rCH-1A接种到MARC-145细胞，观察CPE出现情况，结果(图5)显示，拯救病毒 rCH-1A感染MARC-145细胞36～48 h后，细胞出现聚堆、变圆，甚至脱落等CPE现象，与其亲本病毒CH-1A产生的CPE一致。

2.5拯救病毒rCH-1A分子标记基因的MluⅠ酶切鉴定

结果(图6)显示，亲本病毒CH-1A的RT-PCR扩增产物不能被MluⅠ识别，拯救病毒rCH-1A的RT-PCR扩增产物能被MluⅠ消化成2段，未感染病毒的空白MARC-145细胞没有出现条带。

2.6拯救病毒rCH-1A的IFA分析

IFA检测结果(图7)表明，抗PRRSV N 蛋白单克隆抗体均能和亲本病毒CH-1A、拯救病毒rCH-1A感染后的MARC-145细胞发生特异性反应(可观察到特异性荧光)，而空白MARC-145细胞不能与抗PRRSV N蛋白抗体发生特异性反应。

图 7拯救病毒rCH-1A的IFA检测结果

A.IFA检测亲本病毒CH-1A；B.IFA检测拯救病毒rCH-1A；C.阴性对照

Fig.7Identification of rescued virus in MARC-145 cells by IFA test

A.IFA test of parental CH-1A PRRSV；B.IFA test of rCH-1A PRRSV；C.Negative control

2.7拯救病毒rCH-1A的TCID50测定

检测结果显示：CH-1A TCID50为10-5.47/mL， rCH-1A TCID50为10-6/mL，可见拯救病毒和其亲本病毒的TCID50基本一致。

2.8拯救病毒rCH-1A的多步生长曲线分析

由图8可知，拯救病毒rCH-1A与其亲本病毒CH-1A在MARC-145细胞的生长特性基本一致。

图 8　拯救病毒rCH-1A与其亲本病毒 CH-1A的多步生长曲线比较Fig.8　Viral growth of rCH-1A and CH-1A

3讨论

RNA病毒感染性克隆是指通过体外构建出病毒的cDNA(互补DNA)分子克隆，进而在DNA分子水平上对病毒基因组进行人工操作，再通过转染易感细胞在体外拯救出具有感染性病毒粒子。通过构建RNA病毒感染性克隆的构建，研究者就可以直接精确地改造病毒基因的精细结构，从而确定这些变化对表型性状的直接影响。对RNA病毒而言，这样的操作可以使原来对RNA的操作转变为对DNA的操作，完全克服RNA体外不稳定、易降解等缺点。通过构建病毒的反向遗传操作平台，研究者可以开展针对病毒基因组表达调控机制、病毒致病的分子机理等研究，还可以通过对病毒基因组结构的研究得到减毒毒株或开发新型基因标记的疫苗。截止到目前，大多数病毒的反向遗传操作平台已经构建成功，并利用建立的反向遗传操作系统开展了很多相关的研究，取得很多研究成果[13]。

PRRSV作为目前危害养猪业比较严重的RNA病毒中重要的一员，对其深入研究在很大程度上依赖于病毒感染性cDNA的构建。1998年Meulenberg等[14]建立了第一个欧洲型LV株PRRSV的反向遗传学操作平台；2003年，美洲型代表株VR-2332的PRRSV反向遗传学技术平台也成功建立[15]。随后国内外陆续有不同来源的PRRSV反向遗传技术平台被成功建立[16]。PRRSV反向遗传操作系统经典的构建策略是：首先将PRRSV全基因组通过反转录PCR的方法分段得到病毒cDNA，然后将获得的各个基因片段克隆到合适的载体中，再通过合适的酶切位点将各个基因片段在体外连接装配出含有PRRSV 全基因组的克隆载体，并通过大肠杆菌扩增该阳性克隆。其次，将克隆得到的含PRRSV基因组全长cDNA的克隆载体置于强的转录启动子(如：噬菌体T7、SP6启动子)下，以便于在体外获得PRRSV基因组RNA。再次，通过体外转录获得PRRSV基因组RNA，并通过转染BHK-21细胞或MARC-145细胞进行病毒的拯救。目前，PRRSV反向遗传操作平台的建立大多采用这种方法。该方法需要体外转录才能得到病毒的全基因组RNA。由于体外RNA的不稳定性和体外RNA聚合酶保证度等问题，采用此方法有可能造成试验的失败或者得出与试验设计不一致的结果[12,17]。因此研究者在探索能否使用细胞体内的RNA酶系统，直接在细胞内部获得病毒的基因组RNA，进而克服上述操作的缺点[17-18]。本研究首先对目标克隆载体进行改造，使目标载体获得RNA聚合酶驱动的CMV强启动子以及相关转录元件序列，进而将PRRSV全基因组置于改造好的框架载体，通过真核转染的方式使PRRSV全基因组靶细胞依靠载体中的CMV强启动子以及转录相关元件序列获得病毒的全基因组RNA，进而完成病毒的拯救过程。用此框架载体构建感染性克隆，只需要转染重组质粒就可以启动转录，操作简单方便，同时节省时间和成本，提高了病毒拯救的效率。

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DOI：网络出版时间:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.008

[收稿日期]2014-11-01

[基金项目]国家自然科学基金项目(31402208)；河南省科技攻关项目(162102110037)

[作者简介]徐彦召(1984-)，男，河南许昌人，讲师，博士，主要从事分子病原学与免疫学研究。

[中图分类号]S852.659.6

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)07-0050-07

Construction of infectious clone of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using CMV promoter

XU Yanzhao,WANG Qing,HU Jianhe,YU Juan,CHEN Shijun

(DepartmentofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang,Henan453003,China)

Abstract:【Objective】 A method to rescue porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) using CMV promoter was established to provide operation platform to future study on PRRSV. 【Method】 According to the sequence characteristics of PRRSV and CMV promoter,multiple cloning sequences of pBluescprict Ⅱ SK(+) were modification.Virus full-length cDNA and CMV eukaryotic promoter sequences were then amplified by six pairs of specific designed primers.Enzyme digestion,connection,and transformation were used to recombinant plasmid pSK-CH-1A,which contained CMV promoter and virus full-length cDNA downstream.Then,the recombinant plasmid was transfected into the host cell MARC-145 to obtain rescue virus for CH-1A strain of PRRSV.【Result】 The transcription of viral genomic RNA was synthesized and the infectious virus was rescued after the full-length cDNA clone of pSK-CH-1A containing 19 112 bp was directly transfected into MARC-145 cells.The virus growth characteristics test showed that the rescued virus was similar to parental virus in MARC-145 cells and it could be distinguished from the parental by the mutant genetic marker of MluⅠ enzyme site.【Conclusion】 A simple,convenient,time-saving and low-cost method for constructing infectious cDNA clone of PRRSV was established.

Key words:porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV);CMV promoter;infectious clone

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.016.html