Apelin-13对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究*

蒯锦霞包海军李周儒董国凯殷文江孙晓明李姗姗蔡红星

Apelin-13对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究*

蒯锦霞①包海军①李周儒①董国凯①殷文江①孙晓明①李姗姗①蔡红星①

【摘要】目的：研究Apelin-13对缺血/再灌注小鼠脑损伤的作用，并初步探讨其对自噬性细胞死亡的影响。方法：取健康雄性CD-1小鼠，随机分为假手术（sham）组、生理盐水（Saline）组、Apelin组；Apelin组和Saline组首先建立脑缺血再灌注（MCAO/R）模型，再灌注即刻给予同侧侧脑室注射Apelin-13或等量生理盐水，然后在再灌注48 h后，进行神经功能方面检测，同时利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色评估脑梗死体积；缺血再灌注24 h和48 h后，采用West-blot法检测各组自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果：Apelin-13可显著降低小鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损症状，减少脑梗死体积，减低自噬相关蛋白LC3的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。结论：Apelin-13对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，抑制神经细胞的自噬性死亡可能是其作用机制之一。

【关键词】Apelin-13； 脑缺血再灌注模型（MCAO/R）； 自噬； LC3

First-author’s address：Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，China

脑缺血缺氧可引起的神经细胞结构破坏和脑功能的缺损，脑缺血再灌注损伤是脑缺血缺氧后恢复缺血区血供的又一次损伤，也是一种继发性神经元损伤，与神经细胞的继发性神经元死亡密切相关［1］。近年来有研究表明自噬与脑缺血损伤的发生、发展有着密切的关系［2-3］。研究发现脂肪因子Apelin-13能够对神经细胞的损伤发挥保护作用，但其具体作用机制还不甚明了［4-6］。本实验拟通过观察Aplin-13在脑缺血再灌注损伤中是否起到了保护性作用，并通过检测自噬相关蛋白LC3的表达，研究其对神经细胞自噬的影响，探讨其在缺血再灌注脑损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 共48只健康雄性CD-1小鼠，体重30～35 g（由徐州医学院动物实验中心提供），随机分为如下各组，实验1：sham组6只、Saline组6只、Apelin-13组6只，共18只用于行为学检测和TTC实验；实验2组：sham组、再灌注24 h Saline组、再灌注48 h Saline组、再灌注24 h Apelin-13组、再灌注48 h Apelin-13组，每组6只，共30只用于Western-Blot测定。

1.2 小鼠MCAO/R模型的制备 参照甄毅岚等［6］的线栓法制作左侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。小鼠用7%的水合氯醛（0.05/10 g）腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，酒精擦拭颈部消毒，行颈部正中切口、钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈外动脉近端，在颈总动脉近心端结扎，远心端挂线备用。微动脉夹夹住颈内动脉，在颈总动脉上于分叉处约3 mm处剪一小口，插入专用线栓，将预制的活结稍打紧（防止线栓脱出）。打开夹住颈内动脉的动脉夹，将线栓缓慢插入颈内动脉，大约9 mm时感到有一定阻力停止推进，且向外拔1mm用丝线固定，阻断大脑中动脉起始部血流且不刺破血管。伤口以碘伏消毒，缝合颈部皮肤，保留线栓3～4 mm，术后动物侧卧置于单独的笼内。缺血后60 min，缓慢向外拉线10 mm，使其头端回撤至颈总动脉内，计时实施再灌注。Saline组、Apelin-13组采用线栓法建立小鼠MCAO/R模型；sham组仅给予分离血管，不予结扎及栓塞血管。Apelin组于再灌注即刻给予同侧侧脑室注Apelin-13 （0.33μg/g；注射定位：前囟左侧1 mm，后1 mm，深度2.5 mm），Saline组给予同侧侧脑室等量的生理盐水注射。

1.3 神经功能评分及大脑梗死体积检测 MCAO/R 48 h后，采用改良Bederson评分法进行神经功能缺损评分［7］。评分标准：0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展右侧前爪（左侧手术）；2分，向右侧旋转；3分，行走时向右侧倾倒；4分，不能自行行走。0分及昏迷不醒者剔除。神经功能评分后，对脑组织进行TTC染色，正常组织呈鲜红色，梗死组织呈白色。SD小鼠在水合氯醛麻醉下心内灌注处死，冰板上快速断头取脑。把脑放入-20 ℃冰箱中冷冻，20 min后取出，切成2 mm的冠状切片，泡入1%TTC溶液中，37 ℃水浴箱中30 min，甲醛固定，图象分析仪测梗死体积。每只小鼠脑总梗死体积MV=Σ（A1+A2）t/2，其中t为切片厚度，A1和A2分别表示切块嘴、尾侧梗死面积。同样方法计算同侧大脑半球体积，计算出梗死灶体积占缺血侧大脑半球体积的百分比。

1.4 Western-Blot的检测 Saline组和Apelin-13组按时间点开颅取出小鼠伤侧的海马组织，sham组取同侧海马组织，提取蛋白质，采用12%的SDSPAGE胶进行蛋白质分离，等量（10 μL）蛋白样品上样。恒压电泳，全湿式电转法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，丽春红染NC膜可见清晰的红色条带，表明蛋白质转膜成功。NC膜用5%脱脂奶粉溶液室温封闭NC膜4 h。分别加入一抗（抗GAPDH抗体，1∶1000；抗LC3抗体，1∶5000），4 ℃孵育过夜；二抗（生物素标记羊抗兔IgG，1∶1000稀释），4 ℃孵育1 h；用辣根酶标记亲和素（1∶1000稀释）与二抗结合，4 ℃孵育1 h，以上操作均在摇床上进行，且各步骤间均用TBST洗膜5 min×5次（操作分别按相关试剂盒说明书进行）。膜上加ECL超敏发光液，保鲜膜包好后，暗室内曝光30 s，X线片在显影液中显影2 min，定影液中定影5 min。最后利用Quantity One（Bio-Rid）软件分析蛋白光密度值。

1.5 统计学处理 应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验和方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 按照改良Bederson评分法，统计结果显示：MCAO/R 48 h后， Saline组Bederson评分（3.13±0.23）分与sham组（0.63±0.18）分相比显著升高（P＜0.05），提示脑缺血再灌注后造成明显的神经功能缺损。术后48 h，Apelin-13组Bederson评分（2.38±0.18）分与Saline组相比有所降低（P＜0.01），提示Apelin-13能够显著改善脑缺血再灌注后神经功能的缺失。见图1。

2.2 脑梗死体积检测 脑梗死范围测定是评价脑缺血损伤的金指标，缺血再灌注48 h后，TTC染色，sham组小鼠脑组织表现为均匀一致的鲜红色，无明显梗死灶形成；Saline组和Apelin-13组脑组织出现范围不等的白色梗死区域。Saline组梗死区域体积比例（22.35±1.50）明显高于sham组（0.52±0.20）（P＜0.01），提示脑缺血再灌注后造成明显的大脑梗死。术后48 h， Apelin-13组脑梗死体积比例（10.55±1.01）与Saline组相比明显降低（P＜0.01），提示Apelin-13能够显著降低缺血再灌注小鼠的梗死体积。见图2。

图1 缺血再灌注48 h后神经功能评分检测结果

图2 缺血再灌注48 h后大脑梗死体积比的统计结果

2.3 Western-Blot的检测结果 通过对MCAO/R后受损海马区神经细胞的LC3的表达分析发现，再灌注后24、48 h，Saline组海马区的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（0.366±0.319）、（0.408±0.035）与sham组（0.193±0.034）相比均增加，且在48 h达高峰，Apelin-13组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比 值（0.243±0.031）、（0.291±0.027）与Saline组相比从24 h开始显著降低，并且持续到了48 h，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

Apelin为孤儿G蛋白耦联受体APJ的天然配体，Apelin及其受体APJ广泛分布在中枢神经系统及外周［8-9］，在中枢神经系统 中，Apelin参与应激以及痛觉的调制等生理作用；在心血管系统中，Apelin可调节心肌收缩力和降低动脉血压［10-11］。近年来有研究发现Apelin有显著抑制细胞凋亡的作用［12-13］，而自噬与凋亡有着共同的调节因子，及复杂的相互调节关系。自噬作为一种早期的自我适应性机制，能清除受损的细胞器和蛋白，为组织稳态的恢复提供营养物质和能量［14］。因此通过调控细胞自噬的发生，可成为治疗缺血再灌注脑损伤的一种新的尝试手段。

图3 Western-Blot的检测结果

本实验通过对脑室注射Apelin-13观测其对脑神经的保护作用，结果显示，与Saline组相比，Apelin-13组小鼠神经功能缺失显著降低，表明Apelin-13可明显改善脑缺血再灌注损伤后小鼠的神经功能缺损，发挥保护神经的作用。同时，本实验还采用了TTC染色法观察梗死体积，与Saline组相比，Apelin-13组脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积明显减少，进一步表明Apelin-13对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

通过Western-Blot的检测结果，笔者发现Apelin-13能显著的降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。LC3蛋白是哺乳动物细胞中酵母ATG8基因的同源物，靶向定位于自噬体膜，参与自噬体的形成，被认为是观察自 噬是否存在的标记性分子［15-19］，有Ⅰ型和Ⅱ型之分。哺乳动物细胞发生自噬时，细胞内LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化均明显增加，LC3-Ⅱ含量的多少与自噬泡数量的多少成正比［20-24］。因此，通过检测细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的变化，可以明确地判断自噬水平的高低。本实验中，Apelin-13组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显降低，表明Apelin-13对脑缺血再灌注过程的自噬有显著抑制作用。

综上所述，Apelin-13可明显减轻脑缺血再灌注损伤，保护大脑的功能。通过抑制细胞的自噬可能是其作用机制之一，但是自噬的发生是一个复杂的过程，其具体作用机制还有待于进一步的研究证实。

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①徐州医科大学 江苏 徐州 221002

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.005

收稿日期：（2016-03-29） （本文编辑：蔡元元）

*基金项目：国家自然科学青年基金项目（81302612）；江苏省高校自然指导项目（15KJD180003）

通信作者：李周儒

The Effect of Apelin-13 on Mice after Middle Cerebral Artery Occlusion-Reperfusion Injury

KUAI Jin-xia，BAO Hai-jun，LI Zhou-ru，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：018-021

【Abstract】Objective：To observe the effect of apelin-13 on the brain injury induced by middle cerebral artery occlusion-reperfusion（MCAO/R），and to explore the relationship between apelin-13 and autophagy in MCAO/R. Method：A total of 48 mice were randomly divided into sham，saline and apelin-13 groups.Firstly，mice s MCAO/R model was established using the suture’s method.After MCAO/R， Apelin-13 and saline groups were pretreated with an immediate injection of Apelin-13 and saline into the mice brain lateral ventricle.The effect of neurological deficit scores and the cerebral infarct volume was measured with TTC at 48h after MCAO/R.At last，to determine the role of Apelin-13 on the brain injury induced by MCAO/R，the autophagy associated proteins LC3 were also assessed with western-bloting.Result：Apelin-13 can significantly decreased neural dysfunction and cerebral infarct volume of mice after MCAO/R 48 h.Inadditionally，Apelin-13 also reduce the amount of protein LC3 expression and down-regulated protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio，at 24 h and 48 h after MCAO/R.Conclusion：Apelin-13 preconditioning has obvious protective effect on mice after MCAO/R，and the mechanism may possibly by suppressing neuron autophagy.

【Key words】Apelin-13； MCAO/R； Autophagy； LC3