CCL20及其受体CCR6在COPD气道内及外周血的变化及意义

顾延会，符丹丹，饶习敏，欧阳瑶

(遵义医学院附属医院 呼吸内科，贵州 遵义　563099)

基础医学研究

CCL20及其受体CCR6在COPD气道内及外周血的变化及意义

顾延会，符丹丹，饶习敏，欧阳瑶

(遵义医学院附属医院 呼吸内科，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 研究CCL20、CCR6在COPD大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中的含量及CCL20抗体治疗后的变化，以了解CCL20/CCR6趋化轴在COPD发病过程中的可能作用机制及CCL20抗体的治疗作用。方法 30只Wistar大鼠随机分为正常组、COPD组及CCL20治疗组，每组10只，采用烟熏4周及气道内注入脂多糖(LPS)2次的方法制备COPD组模型，CCL20治疗组模型于造模前第1天腹腔内注入CCL20抗体，余处理同COPD组。3组大鼠均于4周后处死取其肺组织行病理HE染色，同时采用ELISA方法测定BALF及外周血中CCL20、CCR6的含量。结果 COPD组大鼠肺组织病理显示符合人类COPD特征性病理改变，CCL20治疗组肺组织病理显示其病变性质较COPD组减轻。CCL20治疗组大鼠BALF中CCL20及CCR6含量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但低于COPD组，差异均有统计学意义(P<0.05)。CCL20治疗组大鼠外周血中CCL20的含量高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但与COPD组相比差异无统计学意义；外周血中CCR6的含量在3组差异无统计学意义。结论 CCL20及其受体CCR6可能参与COPD发病及进展过程，CCL20抗体可影响CCL20及CCR6在气道内的变化，可改善COPD大鼠一般状态及病理损伤进展。

[关键词]慢性阻塞性肺疾病；Wistar大鼠；CCL20；CCR6

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一种常见病、多发病，死亡率高，其发病机制不明，尚无特效治疗药物[1]。CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20，CCL20)是近来发现的一种CC趋化因子，主要表达在肝脏、肺脏及外周血细胞，与其唯一受体CC趋化因子受体6(CC chemokine receptor 6，CCR6)特异性结合，可能参与气道的慢性炎症及免疫反应过程，即一方面刺激机体发生适当的免疫反应，抵御微生物入侵，另一方面介导病理学组织损伤，那么CCL20/CCR6在COPD发病过程中的可能起着重要作用[2-3]。本文就CCL20、CCR6在COPD大鼠BALF及外周血中的含量及CCL20抗体干预后的变化进行研究，以深入了解COPD的可能发病机制及CCL20抗体的治疗作用。

1材料与方法

1.1实验对象及分组SPF级雄性Wistar大鼠30只，体重(200±20)g，由重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，用随机数字法将其分为3组：正常组、COPD组和CCL20治疗组,每组10只。

1.2主要试剂脂多糖(E.coli055:B5)由美国Sigma公司生产；MIP-3α(G-20)由美国santa公司生产；大鼠巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP-3α/CCL20)ELISA试剂盒、大鼠趋化因子受体6 ELISA试剂盒由美国B&D公司生产，上海西塘生物科技有限公司提供。

1.3模型制备COPD组大鼠于第1天、第15天气道内注入LPS溶液(200 μg/200 μL)0.2 mL，第2天至第28天(除外第15天)于自制烟熏箱内予被动吸烟，上午、下午各1次，每次12支，约30 min，2次至少间隔2 h呼吸正常空气。CCL20治疗组大鼠于第1天注LPS前腹腔注射CCL20单克隆抗体(100 μg/只)，余处理同COPD组。正常组大鼠未予任何干预。

1.4实验标本获取及处理3组大鼠均于4周后麻醉、固定、获取外周血并处死，并立即结扎右肺，取下叶组织约1cm×1cm×1cm行组织病理HE染色；同时回收左侧肺BALF标本(回收率>80%)，离心后取上清液备用，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BALF中CCL20、 CCR6的含量。

2结果

2.13组大鼠一般状况正常组大鼠一般状况良好，体重增加迅速。COPD组大鼠随着烟熏时间延长，一般状况逐渐变差，主要表现在毛发无光泽，消瘦，神情倦怠，活动减少，且行动缓慢。CCL20治疗组大鼠一般状况较健康组差，但较COPD组明显见好。3组大鼠第28天体重变化有差异(F=7.38，P<0.05)；因方差齐，两两比较用LSD法，结果见表1。

表13组大鼠第28天体重比较 (n=10)

组别体重(g)正常组324.18±12.89COPD组242.31±14.71*CCL20治疗组300.03±12.68#

*与正常组比较，P<0.05；#与COPD组比较，P<0.05。

2.23组大鼠第28天肺组织病理学改变正常组：肺泡结构正常连续，支气管管壁未见腺体及炎性细胞浸润。COPD组：肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄或断裂，肺泡腔扩大，部分融合，支气管黏膜上皮脱落，管壁及周围见大量单核细胞和淋巴细胞浸润。CCL20治疗组：小支气管管壁及周围少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，余同COPD组。具体见图1～3及既往发表文章[4-5]。

2.33组大鼠外周血中CCL20及CCR6的含量3组大鼠外周血CCL20总体比较有差异(F=12.78，P<0.05)；因方差齐，两两比较用LSD法，COPD组及CCL20治疗组大鼠外周血中CCL20含量均高于正常对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05，但CCL20治疗组与COPD组相比差异无统计学意义(P>0.05)；外周血中CCR6的含量在3组差异无统计学意义(F=0.78，P>0.05)，具体见表2。

表23组大鼠外周血中CCL20及CCR6的含量(n=10)

组别CCL20CCR6正常组22.25±6.05311.12±29.78COPD组69.35±14.37*264.89±45.34CCL20治疗组68.71±18.02*280.94±30.07

*与正常组相比，P<0.05。

2.43组大鼠BALF中CCL20及CCR6的含量3组大鼠BALF中CCL20及CCR6含量总体比较均有差异(F=32.92，54.65，P均<0.05)；因方差齐，两两比较用LSD法，COPD组及CCL20治疗组大鼠BALF中CCL20及CCR6含量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)；COPD组BALF中CCL20及CCR6含量均高于CCL20治疗组，差异有统计学意义(P均<0.05)，具体见表3。

表33组大鼠BALF中CCL20及CCR6的含量(n=10)

组别CCL20CCR6正常组11.70±8.8043.57±5.51COPD组40.48±19.22*105.81±2.73*CCL20治疗组32.04±10.52*#79.84±11.23*#

*与正常组比较，P<0.05；#与COPD组比较，P<0.05。

3讨论

COPD是一种气道慢性炎症性疾病[1]，其发病机制与多种因素相关，目前认为长期接触有害颗粒，如香烟烟雾，可导致气道的慢性炎症，进而出现不可逆的气流受限和肺功能逐年下降，然而吸烟停止后此过程仍持续存在并进展，可见免疫因素参与COPD进展。故由此可见COPD发病及加重过程中炎症反应及免疫反应共同起着重要的作用，其中趋化因子及其受体参与其中，本课题组既往研究发现CCL20、CCR6[4,6-9]及其他因子[10]通过影响气道内树突状细胞(DCs)变化参与COPD免疫反应及机体炎症反应过程。

趋化因子是一类对炎症细胞有激活、趋化和迁移作用，同时介导免疫反应的小分子多肽。CCL20是CC趋化因子中的一种，其具有专一的受体CCR6，其主要表达在未成熟树突状细胞(iDCs)、B细胞、T细胞及多种肿瘤细胞[11]。CCL20通过趋化CCR6+细胞向抗原出现的组织部位定向迁移。国内外研究发现CCL20/CCR6在炎症反应性疾病、免疫性疾病及肿瘤疾病，如肝炎、动脉粥样硬化、结肠癌、胰腺癌等疾病中均起着重要作用，且研究发现CCL20可通过CCR6对iDCs进行选择性趋化，烟雾及炎症刺激可引起DCs在气道及肺组织内的募集[7-9]，进而影响气道慢性炎症性疾病如COPD、支气管哮喘的发生、发展。既往研究发现敲除CCR6基因可通过阻断CCL20/CCR6轴而减少CCL20、CCR6在气道内的变化，从而减缓COPD进展，但敲除人类CCR6基因可行性小。本实验研究通过烟熏和炎症刺激大鼠制造COPD模型，并通过选定CCL20抗体是否能通过抑制CCL20/CCR6轴阻止CCL20及CCR6在气道内的聚集，进而深入研究人类COPD的发病机制及可能有效治疗措施。

本次实验研究正常组、COPD组和CCL20治疗组大鼠一般情况及肺组织病理，结果发现随着烟熏时间延长及LPS刺激影响，COPD组大鼠一般状况逐渐变差，取其肺组织行病理切片HE染色显示肺气肿表现及大量单核细胞和淋巴细胞浸润等炎症表现，符合人类COPD一般状态及病理改变情况。3组比较，CCL20治疗组大鼠一般状况结果均提示较健康组差，但较COPD组明显见好；病理结果均提示肺气肿程度及肺泡周围炎症细胞浸润程度均较健康组加重，但较COPD组有所减轻。提示烟雾或炎症刺激可引起气道内炎症，且经过反复烟熏及LPS刺激导致气道重建、全身炎症反应，进而导致COPD不可逆的进展，CCL20抗体可能改善COPD大鼠一般状态并延缓病理损伤过程。

本实验中CCL20治疗组大鼠BALF中CCL20及CCR6含量均高于正常对照组，但低于COPD组，差异均有统计学意义(P<0.05)，与既往人体痰液研究[9]中CCL20、CCR6在COPD诱导痰中含量高于正常对照组相符，同时提示气道内CCL20、CCR6的含量变化受CCL20抗体的影响同步增减，可见CCL20抗体可能影响气道局部CCL20、CCR6的变化。外周血中CCL20含量高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但与COPD组相比差异无统计学意义；外周血中CCR6的含量在3组变化不大，差异无统计学意义。提示CCL20抗体不影响外周血中CCR6的变化，可影响外周血中CCL20的变化。故CCL20抗体可能通过影响外周血中CCL20进而影响到气道内CCL20、CCR6的变化。

总之，烟雾或炎症刺激可引起气道内炎症，且经过反复烟熏及LPS刺激导致气道重建、全身炎症反应，进而导致COPD不可逆的进展，CCL20及其受体CCR6可能参与COPD发病过程，可通过CCL20抗体改变CCL20及CCR6在气道内的变化，同时改善COPD大鼠一般状态及延缓病理损伤进展，为人类COPD的进一步防治提供依据。

[参考文献]

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[2] 龙艳红,宋泽庆.CCR6及CCL20在相关疾病中的研究进展[J].吉林医学,2014,35(28)：6365-6367.

[3] 李世敏,孔英君.CCL20与慢性阻塞性肺疾病[J].国际呼吸杂志,2012,32(3):211-214.

[4] 顾延会,欧阳瑶,孙得胜.CCL20抗体对慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血和肺泡灌洗液中树突状细胞表面因子表达的影响[J].吉林大学学报:医学版,2013,39(2):236-240.

[5] 顾延会,欧阳瑶.烟熏联合脂多糖制备大鼠慢性阻塞性肺疾病动物模型[J].重庆医学,2012,41(13):1295-1296.

[6] 顾延会,符丹丹,饶习敏,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管肺泡灌洗液中CD80和CD86的变化及意义[J].遵义医学院学报,2015,38(6):595-598.

[7] 饶习敏,欧阳瑶,顾延会.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中树突状细胞的变化[J].遵义医学院学报,2013,36(5):410-412.

[8] 符丹丹,欧阳瑶,薛令合.CD40和CD86在慢性阻塞性肺疾病患者中的变化及意义[J].遵义医学院学报,2011,34(4):344-347.

[9] 符丹丹,欧阳瑶,薛令合.慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰内树突状细胞及趋化因子受体6水平与FEV1%的相关性[J].中国老年学杂志,2014,34(21):5978-5980.

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[11] Libby P,Ridker P M, Hansson G K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347):317-325.

[收稿2016-03-13;修回2016-04-11]

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81460008)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J字LKZ(2012)08)；贵州省省长基金资助项目(NO：黔科合SY字[2009]3053)。

[通信作者]欧阳瑶，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：COPD发病机制，E-mail:ouyangyao116@sohu.com。

[中图法分类号]R563.3

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)03-0266-04

The changes of CCL20 and its receptor CCR6 in COPD airway and peripheral blood and the therapeutic effect of CCL20 antibodies

GuYanhui,FuDandan,RaoXimin,OuyangYao

(Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To study the contents of CCL20 and CCR6 in COPD rats broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and peripheral blood, and the therapeutic effect of CCL20 antibodies, in order to understand the possible mechanism of CCL20 / CCR6 chemotaxis on the pathogenesis of COPD.Methods 30 Wistar rats were randomly divided into normal group (n=10), COPD group (n=10) and treatment with CCL20 antibody group (n=10). The rats of COPD group were established via cigarette inhalation for 4 weeks and intratracheal lipopolysaccharide (LPS) solution twice totally, and there were intraperitoneal injection of CCL20 antibody in the treatment of CCL20 groups on the first day. The pathomorphology of rats' lung and bronchiole were investigated by HE staining after 4 weeks, while the contents of CCL20 and CCR6 were analyzed with ELISA in the BALF and peripheral blood.Results The changes of pathology of the COPD group of rat lung tissue were the same as those of COPD patients, and the treatment of CCL20 antibody reduced lesions in the COPD group. The contents of CCL20 and CCR6 in BALF of CCL20 antibody group were significantly increased compared with the normal control group (P<0.05), but were significantly decreased compared with the COPD group, there was a difference statistically significant (P< 0.05). The contents of CCL20 in the peripheral blood CCL20 antibody group were significantly increased compared with the normal control group, but there was no difference compared with the COPD group; the contents of CCR6 in peripheral blood in three groups had little changes, there were no differences.Conclusion CCL20 and its receptor CCR6 may participate in COPD pathogenesis process, CCL20 antibody can change the contents of CCL20 and CCR6 in the airway，and can improve the general status and pathologic progression of COPD rats.

[Key words]Chronic Obstructive Pulmonary Disease; Wistar rat;C-C chemokine ligand 20;CC chemokine receptor 6