GeneXpert Mtb/RIF、抗酸染色及培养在浅表淋巴结结核诊断中的比较研究

王　霄，文　强，岳健博，曹志敏，黄　璐，闫　鸿，张建勇，陈　玲

(遵义医学院附属医院 呼吸二科，贵州 遵义　563099)



临床医学研究

GeneXpert Mtb/RIF、抗酸染色及培养在浅表淋巴结结核诊断中的比较研究

王霄，文强，岳健博，曹志敏，黄璐，闫鸿，张建勇，陈玲

(遵义医学院附属医院 呼吸二科，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 比较GeneXpert Mtb/RIF、抗酸杆菌涂片和结核菌培养3种检测技术对诊断浅表淋巴结结核的应用价值。方法 收集2015年4月至2016年1月就诊于遵义医学院附属医院结核及呼吸门诊临床疑诊浅表淋巴结结核患者的淋巴结穿刺液标本32例，将每例标本分为一式三份，分别进行GeneXpert Mtb/RIF、AFB和结核菌培养检测，统计和分析3种实验室检测方法的诊断价值。结果 32例标本中，GeneXpert Mtb/RIF检测25例阳性，阳性率78.1%(25/32)，7例阴性；7例GeneXpert Mtb/RIF阴性患者中6例临床诊断淋巴结结核，抗结核治疗有效，1例确诊为淋巴结炎。抗酸杆菌涂片检测5例阳性，阳性率 15.6%(5/32)，该5例GeneXpert Mtb/RIF检测均阳性。结核菌培养1例阳性，阳性率3.1%(1/32)，行药敏试验提示对利福平耐药，该例抗酸杆菌涂片阳性，且与GeneXpert Mtb/RIF检测存在利福平耐药基因突变相一致。结论 GeneXpert Mtb/RIF在浅表淋巴结结核的诊断中有较高的特异性和敏感性，优于抗酸杆菌涂片和结核菌培养传统诊断方法，值得临床推广应用。

[关键词]GeneXpert Mtb/RIF；抗酸杆菌涂片；结核菌培养；诊断；淋巴结结核

结核病的有效控制在于对结核病患者的快速诊断与治疗。浅表淋巴结结核主要见于颈部淋巴结结核，其次为腋窝淋巴结结核。颈部淋巴结结核是肺外结核中最为常见的结核病之一，通常表现为多个淋巴结肿大、而无明显结核病的全身中毒症状及体征，因此其诊断取决于医务人员对该病的警觉性以及实验室和病理学检查[1]。传统的实验室检测诊断方法特异性和敏感性不尽人意，如AFB检测虽然操作简便、快速、经济，但灵敏性较低[2]；传统固体培养法是结核病诊断的金标准，敏感性较涂片镜检法高，但耗时长，不能进行快速诊断；液体培养法也需1～2周才能获得结果[3]。因此一种可以快速诊断结核病的实验室方法对于临床结核病的快速诊断显得非常重要。近年来，WHO推荐利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert Mtb/RIF)作为快速分子诊断技术用于临床，目前主要用于肺结核痰液的检测，对肺外结核病标本的检验，特别是颈部淋巴结结核的检测，国内尚未见报道。本研究拟通过对淋巴结穿刺液进行Xpert Mtb/RIF、抗酸杆菌涂片及结核菌培养3种检测进行比较，了解Xpert Mtb/RIF在颈部淋巴结结核标本检测中的敏感性和特异性，评价Xpert Mtb/RIF技术在浅表淋巴结结核诊断中的应用价值。

1资料与方法

1.1一般资料收集2015年4月至2016年1月我院结核及呼吸门诊临床疑诊浅表淋巴结结核患者32例，其中疑诊单纯颈部淋巴结结核12例，淋巴结结核合并肺结核19例，腋窝淋巴结结核合并肺结核1例；男性13例，女性19例，年龄14～54岁。颈部浅表淋巴结经B超检查提示淋巴结有液化、坏死，或肉眼见脓肿和/或窦道形成。

1.2方法

1.2.1标本留取收集颈部及腋窝淋巴结结核患者淋巴结穿刺液标本0.05～3 mL，一式3份分别用于XPERT MTB/RIF、抗酸杆菌涂片和结核菌培养检测。课题组2015年获由中国疾病预防控制中心颁发的Xpert Mtb/RIF检测能力验证证书。

1.2.2检测方法

1.2.2.1Xpert Mtb/RIF检测用10 mL高压灭菌的离心管，以1∶2 比例分别加入标本和标本处理液，上下颠倒混匀20次，室温静置15 min，使标本充分液化。利用移液枪将上清转移至反应盒中，将反应试剂盒扫描二维码，录入信息，放入Gene Xpert仪器(美国Cepheid 公司生产)中，2 h后读取结果。结果判断：依照探针的循环阈值，当内参探针循环阈值≤38时检测为阳性，>38则为无效， 提示标本的DNA 提取不合格或含有PCR 抑制物。5个探针中至少2个探针循环阈值≤38即为检测到MTB，可进一步按照探针循环阈值对结核分枝杆菌DNA进行半定量。阈值<16为高含量，阈值为16～22为中等含量，阈值为22～28为低含量，阈值>28为极低含量。检测利福平耐药的基础在于结核分枝杆菌特异性分子早期阈值和晚期阈值之差，即△阈值。系统设置的结果判断标准为△阈值>3.5提示对利福平常见耐药基因存在突变，△阈值<3.5提示对利福平常见耐药基因未见突变。由于终止循环数为38个循环，当早期探针阈值>34.5或晚期探针阈值>38时，利福平耐药结果为不确定。

1.2.2.2抗酸杆菌涂片涂片自然干燥后，经火焰固定，加石碳酸复红溶液盖满玻片，染色5 min，水洗。加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1～2 min，水洗。 加亚甲基蓝溶液，染色30 s，水洗干燥后，镜检。 结果判定按照中国防痨协会基础专业委员会制订的实验室检查规程进行[4]。

1.2.2.3结核分枝杆菌固体培养法取4倍体积的4%NaOH溶于淋巴结穿刺液标本中，间隙振动摇匀15 min，使临床标本充分液化，1 000 rpm 5 min；用一次性无菌吸管取沉淀2～3滴，均匀分布于酸性培养基斜面的上、中、下部，盖紧盖子，将接种标本的培养基管斜放入37 ℃培养箱中，分别于接种后第3、7天观察，1周后每周观察1次，并记录相关结果。

1.2.2.4结核分枝杆菌药敏试验(比例法)用接种环取一环培养基上的单克隆菌落，磨菌器研磨后与标准麦氏管比对并制成1 mg/mL菌悬液，梯度稀释为两个浓度，分别为2～10 mg/mL和4～10 mg/mL，最后接种到含有浓度为40 μg/mL利福平的罗氏固体培养基和空白对照管培养基，37 ℃培养箱培养4～8周，观察结果。

1.3统计分析使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，使用配对χ2检验计算Xpert Mtb/RIF与抗酸杆菌涂片及结核菌培养在敏感性上是否存在差异，P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

32例可疑浅表淋巴结结核患者中，单纯颈部淋巴结结核11例，单纯淋巴结炎1例；颈部淋巴结结核合并肺结核19例，腋窝淋巴结结核合并肺结核1例。

32例淋巴结穿刺液标本中，25例Xpert Mtb/RIF检测阳性，7例阴性，阳性率 78.1%(25/32)；1例结核菌培养阳性，31例阴性，阳性率 3.1%(1/32)，Xpert Mtb/RIF与结核菌培养二者比较，差异有统计学意义(χ2=37.31，P<0.05)；5例抗酸杆菌涂片阳性(+～++++)，27例阴性，阳性率15.6%(5/32)，该5例GeneXpert Mtb/RIF检测均阳性，Xpert Mtb/RIF与抗酸杆菌涂片二者比较，差异有统计学意义(χ2=25.10，P<0.05)。2例Xpert Mtb/RIF检测存在利福平耐药决定区基因突变，提示对利福平耐药，其中1例传统药敏试验提示利福平表型耐药。

表13种检测方法在32例淋巴结穿刺液中的应用比较

检测方法阳性(例)阴性(例)阳性率(%)XpertMtb/RIF25778.1抗酸杆菌涂片52715.6结核菌培养1313.1

3讨论

32例可疑浅表淋巴结结核患者，年龄14～54岁，最终诊断为浅表淋巴结结核31例。31例患者中，男性13例，女性18例。总体来看，结核病(包括肺结核和肺外结核)患者男女比例男性多于女性[5]，但在31例颈部淋巴结结核患者中，女性较男性多，提示女性对于颈部淋巴结结核可能存在一定的易感性，但由于标本量较少，后续需扩大样本量进一步分析。

淋巴结结核目前的诊断主要依靠病理学诊断，对于液化坏死的浅表结巴结结核，其标本难以获得结构较完整的组织行病理学检查；传统的涂片方法耗时较短，但阳性率低；培养方法虽然阳性率较涂片高，但是培养周期长，不能在短时间内得到结果，难以为患者达到早期快速诊断和治疗的目的。本研究收集可疑浅表淋巴结结核患者淋巴结穿刺液标本分别进行Xpert Mtb/RIF、结核菌涂片、传统结核菌培养以及药敏试验检测，评价3种检测技术对诊断浅表淋巴结结核的应用价值。培养阳性的1例标本同时进行Xpert Mtb/RIF检测仍阳性，以结核分枝杆菌培养为金标准，Xpert Mtb/RIF检测结核分枝杆菌的特异性100%；Xpert Mtb/RIF的阳性率为78.1%，较陈海强等[6]在痰液中进行Xpert Mtb/RIF检测的阳性率(59.2%)高。国外文献[7]中在淋巴结结核细针穿刺标本进行Xpert Mtb/RIF检测的阳性率(60.1%)，说明Xpert Mtb/RIF在应用于可疑肺外结核标本的诊断中相比于传统的抗酸杆菌涂片具有更高的价值，并且能够在短时间内(2 h左右)得以诊断。本研究中结核分枝杆菌培养阳性率较低，其原因主要考虑有以下几个方面：①在收集标本的过程中，有些标本量较少，在处理过程中经过稀释，导致培养阳性率降低；②部分患者在收集标本的时候已经经过抗结核治疗，导致标本中菌量减少，培养阳性率低；③抗酸杆菌涂片及Xpert Mtb/RIF检测阳性的标本中部分为死菌，因此虽然涂片和Xpert Mtb/RIF检测阳性，但培养阴性。

传统结核菌药敏试验一般需要4～8周，耗时长，不能及时的为可疑耐药的结核病患者在制定治疗方案方面提供依据。目前研究表明95%的利福平耐药菌株在rpoB基因81 bp 区域(RRDR)存在基因突变[8]，而Xpert Mtb/RIF对于利福平耐药决定区基因突变的检测，耗时短，从基因型上了解结核菌有无利福平耐药，在耐药高发地区从一定程度上能够为临床患者是否对利福平耐药提供依据，为患者治疗方案的制定提供帮助。本研究32例淋巴结穿刺液标本中，Xpert Mtb/RIF检测存在利福平耐药基因突变2例，其中1例标本在传统药敏试验中同时存在利福平表型耐药，提示利福平耐药表型与基因型之间存在一定的关联性，与国外文献报道相符合[9]。但是目前该检测只能针对利福平的耐药相关基因进行检测，尚不能完成其他抗结核药耐药相关基因的检测，且结核分枝杆菌表型与基因型耐药虽然有一定的相关性，但基因型耐药并不能完全代表表型耐药，研究表明利福平表型耐药，但在利福平耐药决定区未发现突变[10]，因此，Xpert Mtb/RIF可快速检测是否有利福平基因型耐药，但在临床工作中仍需结合患者病史及结核菌药敏试验为患者制定合理的治疗方案。

综上所述，Xpert Mtb/RIF作为一种分子诊断技术，在颈部及腋窝淋巴结结核的诊断方面具备快速、特异和敏感的诊断优势，其临床应用能够有效缩短淋巴结结核患者的诊断时间，提高诊断效率，优于抗酸杆菌涂片和结核菌培养传统诊断方法，值得临床推广应用。

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[收稿2016-04-18;修回2016-05-10]

(编辑：王福军)

[基金项目]中国全球基金耐多药结核病规范化诊疗项目(NO：CHN-S10-G14-T)。

[通信作者]陈玲，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：肺部感染和结核病的基础与临床研究，E-mail:Lingjuncd@163.com。

[中图法分类号]R522

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)03-0275-04

Efficiency of GeneXpert Mtb/RIF, AFB and culture on diagnosis of patients with superficial tuberculosis of lymph nodes

WangXiao,WenQiang,YueJianbo,CaoZhimin,HuangLu,YanHong,ZhangJianyong,ChenLing

(Second Department of Respiratory Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective Comparative efficiency of GeneXpert Mtb/RIF, AFB and culture on diagnosis of patients with superficial tuberculosis of lymph nodes.Methods 32 samples of puncture fluids of lymph node from patients with suspicious tuberculous lymphadenitis were collected in the outpatients for TB and respiratory diseases of the second department of respiratory medicine in Affiliated Hospital of Zunyi Medical University from April 2015 to January 2016, each sample was triplicated for assays of GeneXpert MTB/RIF, AFB and mycobacterium tuberculosis culture, respectively.Results 25 (78.1%) out of 32 samples were positive and 7 were negative in GeneXpert Mtb/RIF assay, in the seven negative samples one was lymphnoditis and the others were tuberculous lymphadenitis. 5 (15.6%) were positive and 17 were negative in AFB assay, the positive 5 samples in AFB were consistent with the results of GeneXpert Mtb/RIF. 1 (3.1%) was positive and 31 were negative in culture method, the further assay of drug susceptibility test for the positive samples showed this clinic strain was resistant to Rifampicin,consistent with the result of GeneXpert Mtb/RIF.Conclusion the technique of GeneXpert Mtb/RIF reveals a higher sensibility and specificity than the methods of AFB and culture in diagnosis of tuberculous lymphadenitis and has application values in the future.

[Key words]GeneXpert Mtb/RIF；AFB；tubercle bacillus culture；diagnosis；tuberculous lymphadenitis