人参茎叶总皂苷抑制肺纤维化小鼠血清氧化水平的研究

罗　敏，舒　磊，李映莹，钱志强，石京山，邓　江

(1.遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义　563099；2.遵义医学院 药学院，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

人参茎叶总皂苷抑制肺纤维化小鼠血清氧化水平的研究

罗敏1,2，舒磊1,2，李映莹1，钱志强1，石京山1，邓江1

(1.遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099；2.遵义医学院 药学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察人参茎叶总皂苷(TG)对博莱霉素(BLM)致小鼠肺间质纤维化模型的保护作用。方法 将120只昆明种小鼠随机分为假手术对照组、模型对照组、人参茎叶总皂苷(40、80、160 mg/kg) 组及醋酸泼尼松(5 mg/kg)组。气管内灌注博来霉素(5 mg/kg)建立小鼠肺纤维化模型，制模后连续给药28 d，观察各组小鼠肺组织病理形态改变，检测小鼠血清中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量，总抗氧化能力(T-AOC)、羟自由基(.OH)水平，超氧化物歧化酶(SOD)及髓过氧化物酶(MPO)活力。结果 制模28 d后，模型组小鼠肺系数明显高于假手术对照组(P<0.01)，肺泡炎及肺纤维化明显，血清中.OH、MPO水平及MDA的含量增高，GSH含量、T-AOC水平及SOD的活力显著下降(P<0.05)。与模型对照组比较，TG(80、160 mg/kg)及醋酸泼尼松给药能使模型小鼠的肺系数明显降低(P<0.01)；肺纤维化程度明显减轻，且血清中.OH水平、MPO活力、MDA含量显著下降，而使GSH含量、T-AOC水平及SOD活力明显提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 TG对博来霉素所致的小鼠肺纤维化具有保护作用，其作用机制可能与其抑制氧化损伤有关。

[关键词]人参茎叶总皂苷；肺纤维化；博莱霉素；氧化损伤；小鼠

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)又称为肺间质疾病，是一组由多种病因所引起的弥漫性肺间质疾病[1]，严重危害人类健康。大部分患者因慢性、进行性肺纤维化导致肺动脉高压、呼吸困难、肺源性心脏病和右心衰竭死亡，临床预后差，且肺纤维化一旦形成则很难逆转。其发病机制仍不十分明确，目前尚无有效的药物治疗，常用药物主要有糖皮质激素、免疫抑制剂等，但因其不良反应而成为临床应用受限[1-2]。因此迫切需要积极寻求一种疗效高、不良反应轻的治疗药物用于肺纤维化的治疗。人参皂苷为我国名贵中药人参(PanaxginsengC.A. Mayer)的主要有效成分，生物活性广泛，其对机体许多系统均有调节作用[3-5]。已有的研究表明人参皂苷具抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等多种药理活性[6-8]。人参皂苷类化合物已被证实具有抗氧化，清除氧自由基作用[9]，而氧化损伤在炎症和免疫介导的肺组织损伤及激发纤维化的主要病理过程中扮演了重要角色[10]。为了探索人参茎叶总皂苷是否可通过抗氧化损伤而抑制肺纤维化的病程进展，本研究拟建立博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，探讨人参茎叶总皂苷抗肺纤维化作用，并初步探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1药品、试剂与仪器人参茎叶总皂苷(total ginsenosides, TG)，北京天然药物研究院(纯度98%)；博来霉素(bleomycin, BLM)，浙江海正药业股份有限公司(批号：120901)；醋酸泼尼松(Prednisone)，天津药业集团新郑股份有限公司(批号：141135)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC)、羟自由基(.OH)、髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；Masson试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；全波长酶标仪，美国Thermo公司；Olympus光学显微镜及图像分析系统，日本Olympus公司。

1.2实验动物及分组给药SPF级昆明种小鼠120只，雌雄各半，体重18～22 g，由第三医科大学大坪医院医学实验动物中心提供，许可证号SCXK(渝)2012-0005。小鼠分笼颗粒饲料喂养，自由进食、饮水，适应环境1周后随机分为①假手术对照组(Sham)，②模型对照组(Model，气管内注入BLM 5 mg/kg)，③人参茎叶总皂苷40、80和160 mg/kg给药组(TG-40、TG-80、TG-160)，④醋酸泼尼松5 mg/kg给药组(Prednisone)，各组气管内灌注液体容量为0.1 mL/10g每组20只，雌雄各半。于造模次日灌胃给药(i.g)，假手术与模型对照组均以同体积蒸馏水灌胃，连续给药28 d。

1.3模型制备[11]小鼠称重后以3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离暴露气管，于气管软骨环间隙向心方向气管腔内缓慢注入BLM (5 mg/kg)，注药后立即将小鼠直立沿身体纵轴左右旋转3 min，使药液在双肺内均匀分布，缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送SPF级观察室常规饲养。假手术对照组小鼠在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。所有小鼠术后肌肉注射苄星青霉素预防感染。饲养和实验过程中遵守实验动物管理与保护的有关准则。

1.4动物一般状况及死亡率观察制备模型后，每天观察动物的一般状况如活动情况、毛发、摄食、呼吸等，每5 d称体重1次，根据体重调整给药剂量，连续给药28 d，统计各组动物的存活情况并计算死亡率。

1.5肺系数计算及肺组织病理形态学观察末次给药后，小鼠以3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，取血后取肺组织称重，根据公式计算肺系数：肺系数=肺重(mg)/体重(g)。取右肺下叶，4%中性福尔马林中固定24 h，再经梯度酒精脱水、石蜡包埋切片后，进行Masson及HE染色，观察肺组织病理形态学改变。HE染色细胞核呈蓝色，胞质呈红色；Masson染色可使胶原纤维呈淡蓝色。参照Szapiel等[12]的方法，用HE染色评定肺组织肺泡炎症程度：0级——无肺泡炎，计0分； I级——轻度肺泡炎，受累面积小于全肺的20%，计1分；II级——中度肺泡炎，受累面积为全肺的20%～50%，计2分；III级——重度肺泡炎，全肺呈弥漫性病变分布，受累面积超过全肺的50%，计3分。以Masson染色评定肺组织纤维化程度：0级——无肺间质纤维化，计1分；I级——轻度肺间质纤维化，病变范围小于全肺的20%，计1分；II级——中度肺间质纤维化，病变范围占全肺的20%～50%，计2分；III级——重度肺间质纤维化，病变范围超过全肺的50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱，计3分。

1.6小鼠血清中丙二醛及谷胱甘肽含量、总抗氧化能力及羟自由基水平、超氧化物歧化酶及髓过氧化物酶活力测定麻醉后经眼眶静脉取血，3 500 rpm离心10 min，取上清液留存，用于小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、羟自由基(.OH)水平、髓过氧化物酶(MPO)活力测定，测定方法按试剂盒说明书进行。

2结果

2.1人参茎叶总皂苷(TG)对肺纤维化小鼠一般状态、死亡率及肺系数的影响假手术小鼠活泼好动，毛发光泽发亮，体重逐渐增加，嘴角红润，呼吸平稳，饮食及大便正常；模型组小鼠制模后出现不同程度饮食、活动减少，呼吸急促，精神萎靡，毛枯，1周后出现体重减轻；泼尼松组和TG各给药组小鼠制模开始1周内表现与模型组相似，1周后逐渐好转。制模28 d后，模型组动物死亡7只；泼尼松组死亡2只；TG-40组死亡4只；TG-80组死亡2只；TG-160组及假手术组无动物死亡。且模型对照组小鼠肺系数较假手术对照组显著增加(P<0.05)；与模型组比较，TG及泼尼松给药后小鼠肺系数显著降低(P<0.01，见表1)。

组别组别代码样本量肺系数(mg/g)死亡率(%)假手术对照组Sham206.66±0.220模型对照组Model1313.93±1.04**35泼尼松5mg/kg给药组Prednisone167.83±0.02##10TG40mg/kg给药组TG-401813.43±5.0520TG80mg/kg给药组TG-80209.83±0.27##10TG160mg/kg给药组TG-160187.79±0.60##0

与假手术组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。

2.2人参茎叶总皂苷(TG)对肺纤维化小鼠肺组织病理形态的影响如图1所示，HE染色显示假手术对照组小鼠肺组织结构完整清晰，未见炎性细胞浸润。模型组及TG-40小鼠肺泡结构破坏，间隔增宽，大量炎性细胞浸润，肺纤维化形成。TG-80、TG-160及泼尼松组小鼠肺泡间隔轻度增厚，少量炎性细胞浸润，肺组织纤维化程度减轻。采用Masson染色结果显示(见图2)，假手术对照组小鼠肺组织结构完整，无肺泡炎及胶原纤维。而模型组小鼠肺组织结构紊乱，部分肺泡坍陷融合，可见大量蓝色宽带状及片状胶原纤维，呈弥漫性肺纤维化。TG-80、TG-160及醋酸泼尼松组肺泡壁轻度增厚，出现少量肺泡炎，可见少量丝状或点状蓝色胶原纤维，肺组织纤维化明显减轻。各组肺泡炎和肺纤维化程度评分见表2。

A：假手术对照组；B：模型对照组；C：泼尼松5 mg/kg给药组；D：TG 40 mg/kg给药组；E：TG 80 mg/kg给药组；F：TG 160 mg/kg给药组。图1　人参茎叶总皂苷(TG)对BLM诱导的肺纤维化小鼠病理形态学的影响(HE，×200)

A：假手术对照组；B：模型对照组；C：泼尼松5 mg/kg给药组；D：TG 40 mg/kg给药组；E：TG 80 mg/kg给药组；F：TG 160 mg/kg给药组。图2　人参茎叶总皂苷(TG)对BLM诱导的肺纤维化小鼠病理形态学的影响(Masson，×200)

组别代码样本量肺泡炎评分肺纤维化评分Sham200.00±0.000.00±0.00Model132.65±0.24**2.90±0.21**Prednisone161.92±0.51##2.25±0.62##TG-40182.46±0.662.62±0.51TG-80201.75±0.46##2.13±0.64##TG-160181.63±0.52##1.88±0.35##

与假手术组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。

2.3人参茎叶总皂苷(TG)对肺纤维化小鼠血清中丙二醛及谷胱甘肽含量、总抗氧化能力及羟自由基水平、超氧化物歧化酶及髓过氧化物酶活力的影响模型组小鼠血清中SOD活性、GSH含量及T-AOC水平较假手术组明显降低，MDA含量、.OH水平及MPO活力均显著升高(P<0.05)；TG-80、TG-160及醋酸泼尼松给药组可明显升高小鼠血清中SOD活性、GSH含量及T-AOC水平，而显著降低MDA含量、.OH水平及MPO活力(P<0.05，见表3)。

组别代码SOD活性(U/mL)GSH含量(mg/L)T-AOC水平(U/mL)MDA含量(nmol/mL).OH水平(U/mL)MPO活力(U/L)Sham124.92±19.710.82±0.065.99±0.579.84±0.9859.17±0.663.33±0.01Model88.09±15.33**0.50±0.13**3.24±0.22**19.11±2.13**63.23±0.10**6.72±0.16**Prednisone115.33±25.39#0.66±0.13#5.15±0.37##11.73±1.82##60.66±0.43##3.53±0.14##TG-40102.95±29.710.57±0.043.26±0.2416.09±7.4462.03±0.055.17±0.12TG-80113.69±22.57#0.65±0.044.74±0.29##15.36±3.79#61.61±0.12#4.58±0.27#TG-160125.99±20.88##0.72±0.03##5.93±0.41##11.05±2.03##60.02±0.25##3.44±0.07##

与假手术组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3讨论

肺纤维化是多种弥漫性肺间质疾病的最终转归，其发病机制仍不十分明确，目前尚无特效药物治疗，临床预后差。气管内注入博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型是国际上普遍采用的一种方法，与人类肺纤维化性质相近[13]。本实验通过建立气管内注入博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，研究TG对肺间质纤维化的干预作用。

肺纤维化的形成涉及致病因子对肺泡上皮细胞和血管内皮细胞弥漫性损害，启动炎症免疫反应，有多种炎性细胞参与，释放各种细胞因子和炎性介质，造成组织损伤，并引起间质增生，继而形成纤维细胞、内皮细胞迁移、增殖以及胶原和细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)的代谢紊乱，加重炎症反应，最终导致组织改建和功能损害[14]。在本研究中TG各给药组与模型组比较，造模1周后生存状况逐渐好转，且小鼠死亡率显著降低，表明TG对博来霉素所致小鼠肺纤维化具有良好的防治作用。肺组织病理形态学改变是判断肺纤维化最直观、重要的指标。HE染色和Masson胶原染色结果表明，TG可明显减轻模型小鼠肺泡结构受损及肺泡间隔增厚的程度，减少炎性细胞浸润及胶原纤维含量，表明TG能明显抑制小鼠肺纤维化的发生发展。肺系数是反映肺纤维化程度的指标之一[15]，在肺纤维化的形成过程中，由炎症渗出、细胞肿胀、毛细血管充血等多种因素造成的肺重量增加，而且造模后动物身体状况下降，导致体重减轻，故模型组小鼠肺系数显著升高。本实验中，TG 可显著降低模型小鼠的肺系数，进一步证明了TG防治小鼠肺纤维化的效应。

氧化-抗氧化失衡参与了肺纤维化的形成过程，博莱霉素能刺激肺泡上皮细胞和巨噬细胞，可引起活性氧生成和GSH消除增加及.OH水平增高[16-17]。SOD和GSH是拮抗氧化应激、抑制脂质过氧化反应的重要物质。GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素，在细胞清除氧化物过程中发挥关键作用[18]；T-AOC是非酶促体系的抗氧化物质和酶促体系少数小分子量抗氧化物质的总和，是反映机体抗氧化作用的重要指标之一，可直接反映机体抗氧化酶的活力[19]。MDA是脂质过氧化的终末产物，含量高低也可以反映体内自由基过氧化的程度；.OH是已知氧化性最强和毒性最大的氧自由基[20]，也是导致肺组织氧化损伤的重要因素之一。这些氧自由基和抗氧自由基系统的失衡是导致肺纤维化发病机制之一，Cantin等[21]在1987年首次发表了肺纤维化中氧化应激的研究报告，证实髓过氧化物酶(MPO)活力升高是导致肺纤维化中氧化损伤的另一个发病机制。本实验中，TG-80、TG-160能显著提高肺纤维化模型小鼠血清中SOD、GSH及T-AOC的水平，而降低MDA、.OH及MPO的活力。提示TG通过调节肺纤维化小鼠血清中自由基水平而抑制博来霉素诱导的小鼠实验性肺纤维化。其作用机制是否与影响线粒体氧化应激及细胞凋亡有关，还有待进一步的深入研究。

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[收稿2016-04-08;修回2016-05-16]

(编辑：王静)

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81360660)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：2012-2349)。

[通信作者]邓江，女，教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学、抗炎免疫药理学，E-mail:dengjiang1225@sina.com。

[中图法分类号]R963

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)03-0260-06

Effects of total ginsenosides on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

LuoMin1, 2,ShuLei1, 2,LiYingying1,QianZhiqiang1,ShiJingshan1,DengJiang1

(1.Department of Pharmacology, Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China;2.School of Pharmaceutical Science, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the protective effect of total ginsenosides on bleomycin (BLM) induced differentiation of mouse model with pulmonary fibrosis.Methods 120 Kunming mice (bisexual each half) are randomly divided into Sham-operation control group, model control group, total ginsenosides, TG (40, 80, 160 mg/kg)and prednisone group (5 mg/kg). After molding continuous administration 28 days, we will observe the pathological changes of lung tissue in every group of mice and superoxide dismutase (SOD), malon- dialdehyde (MDA), glutathione (GSH), total antioxidant capacity (T-AOC), hydroxyl radical (.OH), myeloperoxidase (MPO) vitality in serum of mice were detected.Results After molding 28 days, the lung coefficient of model mice is significantly higher than sham group (P<0.01), alveolitis and pulmonary fibrosis become obvious, the content of .OH, MPO, MDA in serum significantly increase (P<0.05), GSH content, T-AOC level and activity of SOD was remarkably decreased (P<0.05). The administration with TG and prednisone to make mice lung index decrease and pathomorphism ameliorate significantly comparing with the model group (P<0.01).Conclusion TG induced protection against pulmonary fibrosis by bleomycin in mice are involved, at least in part, to its inhibitory effects on oxidative damage.

[Key words]total ginsenoside; pulmonary fibrosis; bleomycin; oxidative damage; mice