连翘挥发油对两种烟草仓储害虫的毒杀作用

吴　彦，郭姗姗，韦建玉，张文娟，白　森，邓宾玲，黄东业，白家峰，杜树山*

（1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁 530001；2.北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室，北京100875）

连翘挥发油对两种烟草仓储害虫的毒杀作用

吴彦1，郭姗姗2，韦建玉1，张文娟2，白森1，邓宾玲1，黄东业1，白家峰1，杜树山2*

（1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁 530001；2.北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室，北京100875）

为开发新型烟草仓储防护剂，研究连翘果实挥发油的化学成分及其对烟草仓储害虫的杀虫活性。通过GC-MS分析了连翘果实挥发油的化学成分，运用柱色谱和核磁共振方法分离并鉴定化合物，通过熏蒸、触杀试验测试挥发油及单体成分活性。结果表明，连翘挥发油对烟草甲和赤拟谷盗熏蒸活性的LC50值分别为8.94和7.68 mg/L；触杀活性的LD50值分别为23.66和30.13µg/头。单体化合物中，4-萜品醇对烟草甲的熏蒸和触杀毒性最强（LC50值为6.90 mg/L；LD50值为8.62µg/头）。另外，α-蒎烯，γ-萜品烯和4-萜品醇对两种仓储害虫均具有较好的熏蒸和触杀活性。因此，连翘挥发油及其单体化合物对烟草甲和赤拟谷盗均具有一定防治作用。

烟草仓储；连翘；挥发油；烟草甲；赤拟谷盗

烟叶及成品卷烟在储藏、加工、销售过程中均易遭受虫害。在储存期，烟草仓储害虫对烟叶所造成的影响轻则降低等级，重则完全不能使用，给国家造成了经济损失[1-2]。据报道，我国约有30多种储烟害虫，其中烟草甲（Lasioderma serricorne Fabricius）为优势种，赤拟谷盗（Tribolium castaneum Herbst）为仅次于优势种的种类[3]。防治烟草仓储害虫的方法主要是通过磷化氢熏蒸，但由于长期使用，害虫已对其产生了一定的抗药性[4]，而且化学农药会对环境和人类健康造成一定影响，因而此法也越来越受到相关法规的制约[5-7]。

由于烟草仓储害虫化学防治的上述问题，植物源杀虫剂成为替代合成化学农药防治害虫的良好选择。以天然产物为主要活性成分的植物源杀虫剂一般容易降解，不会对土壤与水源形成持久性影响，对脊椎动物安全性较高，并可控虫害的再猖獗[8]。植物精油是植物源杀虫剂的主要种类，研究发现其对害虫具有触杀、熏蒸、忌避、拒食、抑制生长发育等作用[9-10]，因而越来越受到广泛关注[11]。

连翘为木樨科连翘属植物[Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl]，分布于我国山东、山西、河南、陕西等省[12]。连翘的干燥果实作为中药连翘（Forsythiae Fructus）使用，主要成分为苯乙醇及其苷类化合物、木脂素及其苷类化合物、五环三萜类化合物、黄酮类化合物和挥发油等[13]。目前关于连翘挥发油的研究较多，但主要集中在抗菌，利尿，抗炎等药理作用方面[14-18]，而对烟草仓储害虫的毒杀作用及其有效成分则鲜见报道。因此本研究以连翘挥发油及分离单体化合物为实验材料，以烟草仓储害虫烟草甲和赤拟谷盗为靶标昆虫，进行杀虫活性试验，为开发新型烟草仓储防护剂以及有效防治烟草仓储害虫提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料和仪器

1.1.1试虫烟草甲和赤拟谷盗虫源来自于河南工业大学粮油食品学院，在培养箱（温度28～30℃，相对湿度70%～80%）中人工饲养纯化3代以上。

1.1.2样品木樨科植物连翘F.suspensa的干燥果实购于河北省安国药材市场。连翘果实样本(BNU-CMH-Dushuahan-2013-09-023-016)保存于北京师范大学资源学院北京市重点实验室。连翘果实挥发油（23 mL）由1.3 kg药材按照参考文献[19]的方法制得，并于4℃冰箱保存。

1.1.3仪器和试剂TRACE 200GC/2000MS气相色谱–质联用仪（Thermoquest公司），质谱检索NIST谱库，GHP–9160隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；移液枪（量程范围0.1～2.5、0.5～10和10～100µL，大龙兴创实验仪器有限公司）；Heidolph Laborota 4000型旋转蒸发仪（德国）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（河南巩义科工贸有限公司）；MettlerAE240电子天平（瑞士METTLER公司）；BrukerAvance DRX 500核磁共振谱仪（德国布鲁克公司）。正己烷、乙醚、无水硫酸钠等均为分析纯（北京北化精细化学品有限责任公司）。

1.2方法

1.2.1分析方法GC-MS条件：色谱柱HP-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）熔融石英毛细管柱；载气流速1.0 mL/min恒流模式；进样口温度250℃，传输线温度250℃；进样量1 μL，无分流模式；电离方式：EI；离子源温度：230℃；电离能量：70 eV；四极杆温度：150℃；扫描范围：50～550 amu。经计算机检索NIST数据库，比对各峰值的MS裂片并结合有关文献谱图解析，鉴定化合物种类。采用峰面积归一化法，根据各化学成分的分子质量，计算出各化学成分在挥发油中的相对百分含量（质量分数）。

1.2.2操作方法连翘果实挥发油10 mL，经正相硅胶柱层析，采用正己烷、正己烷–乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脱分段，获得38个馏分段，再经石油醚–丙酮（100:1，体积比）反复硅胶柱层析分离，最终分别从馏分段4-7、12-16和26-29中获得3种单体化合物。经鉴定分别为α-蒎烯[20]（3.31 g）、4-萜品醇[21]（0.37 g）和γ-萜品烯[22]（0.17 g）。

参照文献[19]的方法测定挥发油及单体化合物对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸及触杀活性。每个实验重复3次。

1.2.3测定方法处理后置于恒温培养箱中培养24 h，观察死亡情况前先用力摇动玻璃瓶，再将玻璃瓶倒置，5 min后观察，虫体不动即为死亡。并计算死亡率与校正死亡率。死亡率=（死虫数/试虫数）×100%；校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100%。

1.2.4统计分析方法采用SPSS21.0统计软件分析计算致死中浓度LC50(mg/L)和半数致死量LD50(μg/头)[23]。

2　结果

2.1化学成分分析

由表1看出，连翘果实挥发油为黄色，出油率为1.68%。从连翘挥发油中鉴定出18种化合物，占总含量的94.30%，主要成分为α-蒎烯（63.72%），b-乙酸松油酯（7.47%），4-萜品醇（6.67%），3-异丙基甲苯（3.54%）和γ-萜品烯（2.54%）。气相色谱图见图1。

2.2生物活性

2.2.1熏蒸活性由表2可知，连翘挥发油对烟草仓储害虫烟草甲和赤拟谷盗均有较强的熏蒸毒杀作用，但挥发油对赤拟谷盗的熏蒸毒杀作用更强。分离出的3种化合物对烟草甲的熏蒸毒性强度最大的是4-萜品醇（LC50=6.90 mg/L），而对于赤拟谷盗的熏蒸毒性强度最大的是γ-萜品烯（LC50=4.09 mg/L），这说明不同的化合物对靶标昆虫的作用存在个体性差异。

表1　连翘果实挥发油化学成分及其相对含量Table 1　Chemical constituents of the essential oil derived from F.suspensa fruits

图1　连翘果实挥发油GC-MS气相色谱图Fig.1　Gas chromatogram plot of F.suspensa fruits essential oil

2.2.2触杀活性由表3可知，连翘挥发油对烟草仓储害虫烟草甲和赤拟谷盗均有一定的触杀毒性。在分离出的化合物当中，4-萜品醇对烟草甲和赤拟谷盗的触杀毒性都最强。但与阳性对照相比，4-萜品醇对烟草甲的触杀毒性的LD50是除虫菊素的35.92倍，对赤拟谷盗的触杀毒性的LD50是除虫菊素24.85倍，效果相对较弱。

3　讨论

本研究当中所测得的连翘挥发油成分与以往文献相比较，种类和含量有所不同。孔杰等[26]采用毛细管气相色谱-质谱联用仪测定出的连翘挥发油成分主要为α-侧柏烯(23.8%)，4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-环己烯醇-1(6.82%)，α-3-环己烯甲醇-1(6.82%)，2-异丙烯基-5,5-二甲基环戊烯(5.20%)和柠檬烯(5.20%)。使用超临界CO2萃取技术，段文录等[27]对河南卢氏连翘进行挥发油提取，测定出主要成分为乙酸羽扇烯酸酯(17.07%)，β-蒎烯(16.59%)，角鲨烯(7.56%)和三十六烷(5.39%)等。这说明植物由于生态环境、生长年限等不同可能导致其挥发油成分组成及含量的差异，另外，采样时间、储存时间、提取方法和检测仪器等的不同也可能会使结果出现变化[28-30]。所以为了保证挥发油具有稳定的化学成分和杀虫活性，必须保证原植物从生长到加工的每一环节都尽量减少自然因素和人为因素的影响。

表2　连翘果实挥发油及单体对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性Table 2　Fumigant toxicity of the essential oil of F.suspensa fruits and its constituents against L.serricorne and T.castaneum adults

表3　连翘果实挥发油及单体对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性Table 3　Contact toxicity of the essential oil of F.suspensa fruits and its constituents against L.serricorne and T.castaneum adults

与以往研究相比较，连翘挥发油的杀虫活性较强。其对赤拟谷盗的熏蒸活性强于地枫皮（Illicium difengpi）[31]和三脉紫菀（Aster ageratoides）[32]，对烟草甲的熏蒸活性强于茴藿香（Agastache foeniculum），对赤拟谷盗的触杀作用也强于三叉苦（Evodia lepta）[33]和乌蔹梅（Cayratia japonica）[34]等植物。在本研究中发现挥发油当中的有效成分如4-萜品醇和γ-萜品烯显示出了较强的抗虫活性,验证了之前研究的结果[35-36]，说明连翘挥发油当中的单体化合物对烟草甲和赤拟谷盗具有良好的防治作用。另外，国内外研究表明连翘挥发油当中的桉油精和α-萜品醇对烟草甲具有熏蒸触杀和驱避活性[37]，莰烯对赤拟谷盗具有良好的触杀毒性[38]，这些有效成分都有待于进一步开发利用。据文献报道，连翘挥发油当中的一些成分对其他仓储害虫也有一定的防治效果，如对马鞭草烯酮对玉米象（Sitophilus zeamais）有熏蒸毒杀作用[39]，桃金娘烯醛对德国小蠊（Blattella germanica）有驱避作用等[40]。这些成分也可能对烟草甲和赤拟谷盗具有一定的防治作用，需要在今后的研究中加以证实。

4　结论

本研究分析了连翘果实挥发油的化学成分，评价了挥发油及分离出的单体化合物对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸和触杀活性，确定了连翘果实挥发油对这两种烟草仓储害虫的防治作用。虽然作用效果低于阳性对照，但因其作为中药长期使用，具有较高安全性，并且提取方法简单，出油率高，资源丰富，仍具有很大开发前景。然而，目前有关连翘果实挥发油及其单体化合物对烟仓害虫的其他防治作用及作用机理仍需要进一步研究。

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Insecticidal Activities of the Forsythia Suspensa Essential Oil Against Two Tobacco Storage Insects

WU Yan1,GUO Shanshan2,WEI Jianyu1,ZHANG Wenjuan2,BAI Sen1,DENG Binling1, HUANG Dongye1,BAI Jiafeng1,DU Shushan2*
(1.Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co.,Ltd.,Nanning 530001,China;2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Protection and Utilization,Beijing Normal University,Beijing 100875,China)

Bioactivity screening was conducted in order to develop new botanical pesticides against tobacco storage pests.The essential oil obtained from the fruits of Forsythia suspensa was investigated by GC-MS.A total of 18 components representing 94.30%of the oil were identified and the main compounds in the oil were found to be α-pinene(63.72%),b-terpinyl acetate(7.47%), 4-terpineol(6.67%),3-isopropyltoluene(3.54%)and γ-terpinene(2.54%).It was found that the essential oil exhibited strong fumigant toxicity against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum adults with LC50values of 8.94 and 7.68 mg/L air. Meanwhile,the essential oil exhibited contact toxicity against T.castaneum and L.serricorne adults with LD50values of 23.66 and 30.13µg/adult.Among the three individual compounds,4-Terpineol showed the strongest fumigant and contact activities(LC50= 6.90 mg/L;LD50=8.62µg/adult)against L.serricorne.Meanwhile,α-pinene,γ-terpinene and 4-terpineol exhibited strong bioactivities against T.castaneum.The results indicated that the essential oil of F.suspensa and its isolated compounds have the potential to be developed into natural insecticides for controlling insects in stored tobacco.

tobacco storage;Forsythia suspense;essential oil composition;Lasioderma serricorne;Tribolium castaneum

S435.72

1007-5119（2016）03-0067-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.012

广西科学研究与技术开发计划课题“广西特色植物提取物防治烟叶仓储虫害的应用研究及机理分析”（桂科攻15118004）；北京市自然基金“竹叶花椒防治药材仓储害虫活性物质基础及作用机理研究”（7142093）

吴彦（1972-），博士，副研究员，主要从事天然植物在卷烟减害增香中的应用研究及药理学研究。E-mail：abelabel@126.com*通信作者，E-mail：dushushan@bnu.edu.cn

2015-11-24

2016-03-24