婴儿配方乳粉原辅料中细菌的分离鉴定

娄彬彬，郭 鸰，周彦宏，冯 婧，孙露宏，李明雨，牛婕婷，费 鹏，满朝新，姜毓君

（东北农业大学a.食品学院，乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030）

婴儿配方乳粉原辅料中细菌的分离鉴定

娄彬彬a，郭 鸰a，周彦宏a，冯 婧a，孙露宏a，李明雨a，牛婕婷a，费 鹏a，满朝新b，姜毓君ab

（东北农业大学a.食品学院，乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030）

利用传统可培养方法对采集自婴儿配方乳粉加工厂的14类、42份原辅料样品进行细菌的分离，并采用16S rDNA基因测序技术对分离的细菌进行分子鉴定。结果表明：乳糖、氯化钾、维生素、低聚果糖、棕榈油和乳铁蛋白共6类原辅料中没有发现细菌，其他8类原辅料中共分离出36株细菌，包含了6个属10个种。原料乳和乳清粉是主要的细菌分离来源，共分离到11株和8株细菌，分别占总分离菌株的30.6%和22.2%。肺炎克雷伯菌和格氏乳球菌是优势菌株，共占总分离菌株的52.7%。

婴儿配方乳粉；原辅料；细菌；分离鉴定；16S rDNA分析

0 引言

作为母乳的有效替代物，婴儿配方乳粉为婴儿提供了生长发育所必需的几乎全部的营养［1，2］。我国的奶粉市场中，婴幼儿配方乳粉占有重要的比例且具有逐年上升的趋势，对婴幼儿配方乳粉的需求量也在逐渐增加［3］。然而，婴儿配方乳粉并不是一个无菌的产品，存在于婴儿配方乳粉中的细菌可能导致婴儿致病［4-6］。为此国家制定了婴幼儿配方奶粉以及相关原辅料的国家标准［7，8］。研究人员针对婴儿配方乳粉中的微生物检测及遗传多样性研究甚多，但对于原辅料中细菌的研究相对较少［9，10］。因此本文对婴儿配方乳粉生产所需的原辅料中细菌进行分离鉴定，为原辅料的验收及管理提供依据。

1 实验

1.1 材料

样品采集：研究中所用的14类、42份婴儿配方乳粉原辅料样品，由本实验室人员于某婴儿配方乳粉加工厂中采集。样品采集后立即4℃保存，进行后续实验。

培养基及主要试剂：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），Luria-Bertani（LB）液体培养基，缓冲蛋白胨水（BPW），2×Taq PCR MasterMix，细菌基因组DNA提取试剂盒。

主要仪器与设备：低温采样箱，Bcn1360型生物超净工作台，DHP-9272型电热恒温培养箱，电热恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，TGC-16G型离心机，9700 PCR扩增仪，DYY-10C型电泳仪，UVP凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集

本实验连续三天采集同一批次婴儿配方乳粉的原辅料14类，共42份，包括：原料乳、α-乳白蛋白、乳清粉、酪蛋白磷酸肽、碳酸钙、营养素、乳糖、氯化钾、维生素、核苷酸、矿物质、低聚果糖、乳铁蛋白以及棕榈油。针对粉状样品，每类原辅料无菌采集约200 g；针对液体样品，每类原辅料无菌采集约200 mL。收集到的原辅料立即放在低温采样箱中保存，并送回实验室进行后续实验。

1.2.2 样品中细菌的分离

分别称取25 g样品于灭菌后的225 mL BPW三角瓶中，充分混合溶解，进行适当的梯度稀释后，吸取0.1 mL涂布于TSA固体培养基，每个样品3个平行，后放置于37℃恒温培养箱中培养24 h，选取形态不同的单一菌落于LB液体培养基中37℃培养24 h。针对非单一菌落需在TSA固体培养基上三区划线，37℃培养24 h后挑取单菌落，置于液体LB培养基中进行纯培养，连续传代2次后进行后续试验。

1.3 细菌基因组DNA的提取与PCR扩增

1.3.1.细菌基因组DNA的提取

取2 mL菌液，按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行DNA的提取。

1.3.2.16S rDNA序列的PCR扩增

利用16S rDNA通用引物27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行序列的扩增［11］。PCR扩增体系为：16 μL 2×Taq PCR MasterMix，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，30 μL ddH2O。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃末端延伸7 min。取5 μL PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，并在凝胶成像系统下观察电泳条带情况。

1.4 细菌16S rDNA序列的测序分析

将片段大小在1 500 bp左右的PCR扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司北京分公司进行纯化和双向测序。利用DNAMAN 5.29软件对双向测序的结果进行拼接，拼接后的序列与NCBI的BLAST数据库中已知序列进行比对，进而完成对分离菌株的鉴定工作。并利用MEGA6.0对收集到的最优势菌株的序列构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 原辅料中菌落数量

收集的14类，共42份婴儿配方乳粉原辅料，经前期适当稀释、培养，挑取固体培养基TSA上菌落形态不同的单一菌落后，进一步分离、纯化处理，共分离出36株，其中原料乳中11株、乳清粉中8株、矿物质中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白磷酸肽2株、碳酸钙中3株、营养素中3株和核苷酸中2株。

2.2 原辅料中细菌的分子鉴定

2.2.1 细菌DNA提取

利用细菌基因组DNA提取试剂盒对分离的36株细菌进行DNA提取，并在1%的琼脂糖凝胶电泳上检测，结果如图1所示。提取的分离菌株DNA只有一条清晰的条带，没有其他杂带干扰，说明DNA的提取结果符合要求，可以用于后续的扩增实验。

图1 部分分离菌株的DNA提取电泳结果

2.2.2 PCR扩增

利用通用引物对分离菌株进行PCR扩增，图2为部分分离菌株的PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上的检测结果。通过与标准条带比较，可以看到分离菌株的PCR产物条带大约为1 500 bp左右，且均为单一清晰条带，没有引物二聚体存在，说明分离菌株的16S rRNA基因扩增比较成功，可以用于后续基因测序。

图2 部分分离菌株的PCR产物电泳结果

2.2.3 16S rDNA序列的鉴定

分离得到的36株细菌的16S rDNA序列经DNAMAN 5.29软件剪切和拼接后，与BLAST数据库中的序列进行同源性比对。关于分离菌株的16S rDNA鉴定结果及分离来源等信息如表1所示。结果表明14类，42份婴儿配方乳粉原辅料样品中共分离出36株细菌，包含了克雷伯氏菌属（Klebsiella）14株、乳球菌属（Lactococcus）11株、肠球菌属（Enterococcus）7株、芽孢杆菌属（Bacillus）2株、耶尔森氏菌属（Yersinia）1株、不动杆菌属（Acinetobacter）1株，共6个菌属。包含了9个种，分别是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）和申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）。

2.3 原辅料中细菌的分布及组成

作为婴儿配方乳粉生产的主要原料，原料乳和乳清粉中发现较多的细菌。原料乳中共分离出了11株6种细菌，分别是肺炎克雷伯菌（3株）、格氏乳球菌（3株）、变栖克雷伯氏菌（2株）、乳酸乳球菌（1株）、粪肠球菌（1株）和枯草芽孢杆菌（1株）；乳清粉中发现了8株细菌，包括肺炎克雷伯氏菌（3株）、变栖克雷伯氏菌（1株）、格氏乳球菌（2株）、粪肠球菌（1株）和小肠结肠炎耶尔森氏菌（1株）。部分辅料（矿物质、酪蛋白磷酸肽、碳酸钙和营养素）中发现相对较少的细菌。其他辅料（乳糖、氯化钾、维生素、低聚果糖、棕榈油和乳铁蛋白）中没有发现细菌。一方面说明生产婴幼儿配方乳粉所使用的某些原辅料存在一定数量的细菌。另一方面表明婴儿配方乳粉中分离到的细菌也可能来自于辅料。此外，由于原料乳以及乳清粉中含有较多的细菌，因此在原料乳、乳清粉的验收、存贮等过程中要更加重视微生物数量的控制，防止微生物的繁殖，同时对婴儿配方乳粉生产所用的原辅料应该实施更加严格的监管措施，从进厂到添加要有详细的记录信息。

魏琳琳，胡萍［12］等人指出，肺炎克雷伯菌是重要的条件致病菌和医源性感染菌，可能引起多种感染。在婴儿配方乳粉中分离出的肺炎克雷伯菌等肠杆菌可能引起婴幼儿感染，严重者可造成后遗症和死亡［13-15］。本实验中并未对半成品、成品干粉进行研究，仅在原辅料中发现了肺炎克雷伯菌，后续可能对干粉进行分析，来探究婴儿配方乳粉中是否存在肺炎克雷伯菌以及该菌是否来源于原辅料。

2.4 16S rRNA基因序列系统发育树

肺炎克雷伯菌作为主要的分离菌株，在多种原辅料中均被发现，为探究菌株的基因差异是否与样品有关，将获得的11株肺炎克雷伯菌以及3株参考菌株的16S rRNA基因序列利用MEGA6.0软件构建系统发育树，结果如图3所示，表明所有分离菌株分为了4个类群，A26、A25、A22、A1、A5、A4和A6，共7株菌形成一个系统发育分支；A28与参考菌株KJ741255聚为一个类群，A16与A17两株菌形成一个系统发育分支；而A18独自一类群，且与其他菌株相距较远。

通过对分离菌株的来源进行探究，发现发现亲缘关系较近的7株菌（A26、A25、A22、A1、A5、A4和A6）大多数分离自原料乳和乳清粉，其中A26、A25和A22均分离自原料乳且形成一个系统发育分支；A1与A5分离自乳清粉中；A4也分离自乳清粉，尽管与A1和A5在一个大分支下，却与分离自矿物质中的肺炎克雷伯菌A6在同一小分支上。分离自营养素的菌株A17与A16聚集在一起，而与其他分离来源的菌株存在距离。此外，分别分离自酪蛋白磷酸肽以及碳酸钙的A28和A18形成独立分支。图3为原辅料中分离株的肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因序列的系统发育树。

表1 分离的36株细菌菌株的16S rDNA鉴定结果

图3 16S rRNA基因序列的系统发育树

菌株的分离来源：A26-原料乳，A25-原料乳乳，A22-原料乳，A5-乳清粉，A1-乳清粉，A4-乳清粉，A6-矿物质，A16-营养素，A17-营养素，A28-酪蛋白磷酸肽，A18-碳酸钙。

3 结论

本研究对14类，共42份婴儿配方乳粉原辅料进行的细菌分离与鉴定，结果表明，6类原辅料中没有发现细菌，分别是乳糖、氯化钾、维生素、低聚果糖、棕榈油和乳铁蛋白。其他8类原辅料中共分离出36株细菌，包含了6个属10个种。其中原料乳和乳清粉是主要的细菌分离来源，分离了11株和8株细菌，分别占总分离菌株的30.6%和22.2%。肺炎克雷伯菌和格氏乳球菌是优势菌株，共占总分离菌株的52.7%。本研究对加强婴儿配方乳粉生产所需的原辅料的验收及监管提供依据。

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Isolation and identification of bacteria from raw materials of powdered infant formula

LOU Bin-bina，GUO Linga，ZHOU Yan-honga，FENG Jinga，SUN Lu-honga，LI Ming-yua，NIU Jie-tinga，FEI Penga，MAN Chao-xinb，JIANG Yu-juna，b（Northeast Agricultural University a.Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science；B.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150030，China）

In this study，bacteria were isolated by traditional cultivation-based method from 14 categories，42 samples of raw materials collected from powdered infant formula factory，and then identified the bacterial isolates by 16S rDNA sequence analysis.The results showed that bacteria were not found from the 6 kinds of raw materials，including lactose，potassium chloride，vitamin，fructo oligosaccharide，palm oil and lactoferrin.A total of 36 isolates were isolated from the other 13 different raw materials，and all the isolates were classified into 6 genera and 10 species.Raw milk and whey powder were the main sources of isolated bacteria，and 11 and 8 bacteria were collected，accounting for 30.6%and 22.2%of the total isolates，respectively.Klebsiella pneumonia and Lactococcus garvieae were considered as the most prominent genera with a relative proportion of 52.7%of the total isolates.

powdered infant formula；raw materials；bacteria；jsolation and identification；16S rDNA analysis

TS252.51

A

1001-2230（2016）08-0009-03

2015-12-30

国家科技支撑计划课题（2013BAD18B11）；黑龙江省杰出青年科学基金（JC201415）、黑龙江省科研机构创新能力提升专项计划项（YC13D005）；东北农业大学研究生科技创新基金（yjscx14060）。

娄彬彬（1991-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

姜毓君