Rho激酶在氢气保护LPS诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍中的机制研究

马小叶，于洋，张红涛，谢克亮，2，于泳浩，2△

细胞与分子生物学

Rho激酶在氢气保护LPS诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍中的机制研究

马小叶1，于洋1，张红涛1，谢克亮1，2，于泳浩1，2△

摘要：目的探讨Rho激酶（ROCK）在氢气改善离体脓毒症肠屏障功能中的作用。方法常规培养人结肠上皮细胞Caco-2，分为6组（n=3）：对照组（C组）、富氢培养基组（H组）、脂多糖（LPS）处理组（L组）、富氢培养基+LPS组（HL组）、Rho激酶抑制剂Y-27632组（Y组）、Y-27632+LPS组（YL组）。H组给予0.6 mmol/L富氢培养基；LPS和Y-27632的处理浓度分别为50 mg/L、25 μmol/L。建立Transwell小室模型，定期检测跨上皮电阻值（TEER值），当TEER值达到800 Ω·cm2后给予处理，于6、12、24 h检测TEER值，24 h时检测FITC-右旋糖酐通过率。细胞接种于6孔板，融合达80%～90%后给予处理，实时聚合酶链式反应技术检测闭锁小带蛋白1（ZO-1）mRNA和ROCK mRNA表达情况；蛋白免疫印迹技术检测ZO-1蛋白和ROCK蛋白表达水平。结果与C组比较，H组12、24 h TEER值升高（P＜0.05），FITC-右旋糖酐通过率、ZO-1蛋白和ROCK蛋白表达水平差异无统计学意义；Y组6、12、24 h TEER值升高（P＜0.05），FITC-右旋糖酐通过率差异无统计学意义，ZO-1 mRNA表达增加，ROCK mRNA表达减少（均P＜0.05）；L组6、12、24 h TEER值降低，FITC-右旋糖酐通过率增高，ZO-1 mRNA和蛋白表达均下降，ROCK mRNA和蛋白表达均增加（P＜0.05）。与L组比较，6、12、24 h YL组TEER值增高，FITC-右旋糖酐通过率降低，ZO-1 mRNA表达增加，ROCK mRNA表达降低（均P＜0.05）。与L组比较，HL组6、12、24 h TEER值增高，FITC-右旋糖酐通过率降低，各时间点ZO-1蛋白表达上升，ROCK蛋白表达下降（均P＜0.05）。结论氢气可保护脓毒症肠屏障功能，改善肠上皮屏障完整性和通透性，增加肠细胞间紧密连接蛋白表达，这些保护机制可能与氢气抑制LPS诱导的ROCK过度表达有关。

关键词：rho相关激酶类；氢；脂多糖类；脓毒症；Caco-2细胞；肠上皮屏障功能

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81071533，81372033）；天津市应用基础及前沿技术研究计划（13JCQNJC11400）

作者单位：1天津医科大学总医院麻醉科（邮编300052）；2天津市麻醉学研究所

作者简介：马小叶（1989），女，硕士在读，主要从事氢气对脓毒症器官功能保护方面的研究

△

通讯作者E-mail:yuyonghao@126.com

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器胎牛血清（BioInd公司，以色列）；DMEM高糖培养基（Hyclone公司，美国）；GCH300高纯氢气发生器（天津同普分析仪器科技有限公司）；Transwell小室（Corning公司，美国）；EVOM细胞电阻仪（WPI公司，美国）；FITC-右旋糖酐、大肠杆菌脂多糖（LPS）、Rho激酶抑制剂Y-27632（Sigma公司，美国）；热启动荧光定量PCR试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；小鼠单克隆抗闭锁小带蛋白1 （zonula occludens-1，ZO-1）抗体、兔单克隆抗ROCK抗体（Abcam，英国）；小鼠单克隆抗β-actin抗体、HRP标记山羊抗小鼠抗体、HRP标记山羊抗兔抗体（杭州华安生物技术有限公司）。

1.2Caco-2细胞培养人结肠上皮Caco-2细胞购自上海中科院细胞库，以含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，培养基中加入1%青霉素-链霉素双抗。生长状态良好的细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，1∶2传代，于37℃，5%CO2培养箱中贴壁培养，传代24 h后更换培养基，以后每隔1 d更换1次培养基，5～6 d传代1次。

1.3富氢培养基制备通过高纯氢气发生器将高纯度氢气（纯度＞99.999 9%）加压充入DMEM高糖培养基中。富氢培养基现用现配，以氢电极检测氢气浓度为0.6 mmol/L，过滤消毒后留作细胞处理。

1.4分组及处理

1.4.1实验分组取状态良好，处于生长对数期的Caco-2细胞进行实验。实验分为对照组（C组）、富氢培养基组（H组）、LPS处理组（L组）、富氢培养基+LPS组（HL组）、ROCK抑制剂Y-27632组（Y组）、ROCK抑制剂Y-27632+LPS组（YL组）。C组与H组分别加入等容量DMEM高糖培养基和0.6 mmol/L富氢培养基。LPS处理浓度为50 mg/L，Y-27632处理浓度为25 μmol/L。

1.4.2Caco-2细胞单层模型的建立和模型完整性检验取生长状态良好的Caco-2细胞以5.5×105个/mL的密度接种于Transwell小室内（500 μL/孔），外室内加培养基600 μL/孔。接种24 h后换培养基，接种后第1周隔1 d换1次培养基，之后每天更换培养基。每天在显微镜下观察小室内细胞生长情况，定期用EVOM细胞电阻仪检测小室底层细胞跨上皮电阻值（TEER），具体操作方法参照仪器说明书。当TEER值达到800 Ω·cm2后分别给予细胞6组不同处理（n=3），于37℃温箱中无菌孵育，分别于处理前（0 h），处理后6、12、24 h检测TEER值。若TEER值降低则表明模型的完整性降低。

1.4.3Caco-2细胞单层模型通透性的检测同上述建立Caco-2细胞小室模型，TEER值达800 Ω·cm2后分别给予6组不同处理（n=3），于37℃温箱中孵育至24 h。小心吸出内室及外室的培养基，无菌PBS清洗3次，向内室中加入1 g/L FITC-右旋糖酐，外室中加入无菌PBS。避光置于37℃温箱中，2 h后在外室取样100 μL于黑色96孔板中，荧光分光光度计检测FITC的荧光强度。

1.4.4实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测ZO-1和ROCK mRNA表达将培养的Caco-2细胞制成单细胞悬液，细胞计数后以1×106/mL密度均匀接种于6孔板，2 mL/孔。细胞融合达80%～90%时，分别给予细胞C组、L组、Y组和YL组4种处理（n=3），培养24 h后用Trizol试剂法提取细胞总RNA。用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA（2步法），SYBR GreenⅠ法进行RT-PCR检测。引物序列为：GAPDH引物上游 5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′，下游 5′-CAGT⁃GGGAACACGGAAAGC-3′；ZO-1引物上游5′-AAAGTGCT⁃GGCTTGGTCTGT-3′，下 游 5′-TAGGTGACGCTGGGT⁃GATAG-3′；ROCK引物上游5′-TCCTCTGCTAAGTCTC⁃CATCG-3′，下游5′-GACAGCCTCACTCTCCCATT-3′，扩增片段长度分别为206、105、103 bp。94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环后72℃延伸7 min，每个循环在72℃时采集荧光，所得Ct值用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.4.5蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测ZO-1及ROCK蛋白表达6孔板培养细胞至细胞融合达80%～90%时，给予C组、H组、L组、HL组4种处理（n=3），分别于6、12、24 h用细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白经6%SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h后分别孵以小鼠抗ZO-1抗体（1∶200）、兔抗ROCK抗体（1∶500）、小鼠抗β-actin抗体（1∶2 000）4℃过夜。TBST洗膜后，分别孵育辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗鼠或山羊抗兔抗体，室温下置于摇床上1 h。TBST清洗后于暗室中滴加显影液显影。Bio-Rad图像分析系统分析条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白灰度值比值得到目的蛋白相对表达量。

1.5统计学方法应用SPSS 18.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1显微镜下观察各组处理后细胞形态改变倒置显微镜下观察可见C组、H组、Y组细胞生长状态良好，细胞连接紧密，呈鹅卵石状，形态饱满，折光性好。L组细胞数目显著减少，细胞生长分散稀疏，相邻细胞间彼此脱离，细胞形态改变，呈不规则状，折光性减弱；随时间延长，这些改变更加明显。HL组和YL组与L组相比细胞数量增多，生长更紧密，折光性增强。

2.2Caco-2细胞小室模型TEER值和小室FITC-右旋糖酐通过率的改变与C组相比，H组12、24 h TEER值升高；Y组6、12、24 h TEER值升高（P＜0.05）；L组、HL组和YL组细胞6、12、24 h TEER值均降低（P＜0.05）。与L组相比，HL组和YL组6、12、24 h TEER值增高（P＜0.05）。处理24 h后，与C组相比，L组、HL组和YL组小室模型FITC-右旋糖酐通过率升高（P＜0.05），与L组相比，HL组和YL组小室FITC-右旋糖酐通过率降低（P＜0.05）；H组和Y组小室FITC-右旋糖酐通过率与C组相比差异无统计学意义。见表1。

2.3Caco-2细胞ZO-1 mRNA与ROCK mRNA表达与C组相比，Y组ZO-1 mRNA表达显著增多，L组和YL组ZO-1 mRNA表达减少；YL组比L组表达量增多，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与C组相比，Y组ROCK mRNA表达显著减少，L组和YL组显著增加；与L组相比，YL组ROCK mRNA表达减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

2.4Caco-2细胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白表达量与C组比较，3个时间点处L组ZO-1蛋白表达均有下降（均P＜0.05）；与L组相比，HL组ZO-1蛋白表达均升高（均P＜0.05）。与C组相比，3个时间点L组ROCK蛋白表达均增加，与L组相比，HL 组ROCK蛋白表达下降，随时间延长下降幅度增加，但仍高于C组（均P＜0.05）。各个时间点H组与C组ZO-1蛋白和ROCK蛋白表达差异均无统计学意义。见图1、表3。

Tab.1　Effects of different treatments on TEER value and FITC-dextran permeability of Caco-2 cell chamber model表1　不同处理对Caco-2细胞小室模型TEER值和FITC-右旋糖酐通过率的影响　　（n=3,±s）

Tab.1　Effects of different treatments on TEER value and FITC-dextran permeability of Caco-2 cell chamber model表1　不同处理对Caco-2细胞小室模型TEER值和FITC-右旋糖酐通过率的影响　　（n=3,±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与L组比较，P＜0.05

组别C组H组L组HL组Y组YL组F TEER相对值（%）0 h 100.00±2.38 101.00±2.82 100.60±3.41 100.24±2.80 100.84±2.71 101.20±2.50 0.082 6 h 101.61±2.07 103.13±2.41 78.30±3.14a90.61±3.04ab105.72±3.03ab93.70±2.80ab40.642＊＊12 h 103.50±2.02 108.30±2.02a74.72±2.48a91.30±2.32ab107.60±2.12ab88.84±2.64ab100.272＊＊24 h 103.94±2.17 110.74±2.25a71.57±2.44a94.70±2.98ab108.12±2.27ab87.95±2.54ab108.416＊＊FITC-右旋糖酐通过率（24 h）1.00±0.19 0.86±0.18 2.27±0.21a1.47±0.21ab0.89±0.20b1.54±0.19ab22.477＊＊

Tab.2　The effects of Y-27632 on ZO-1 mRNA and ROCK mRNA expressions in LPS-induced Caco-2 cells 表2Y-27632对LPS诱导Caco-2细胞ZO-1 mRNA和ROCK mRNA表达改变的影响　（n=3，±s）

Tab.2　The effects of Y-27632 on ZO-1 mRNA and ROCK mRNA expressions in LPS-induced Caco-2 cells 表2Y-27632对LPS诱导Caco-2细胞ZO-1 mRNA和ROCK mRNA表达改变的影响　（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与L组比较，P＜0.05

组别C 组L 组Y 组Y L 组F Z O -1 m R N A 1 . 0 0 ± 0 . 0 9 0 . 4 7 ± 0 . 0 9a1 . 3 8 ± 0 . 1 0ab0 . 7 1 ± 0 . 1 7ab3 5 . 2 6 4＊＊R O C K m R N A 1 . 0 0 ± 0 . 1 3 1 . 7 5 ± 0 . 2 1a0 . 4 5 ± 0 . 1 3ab1 . 3 3 ± 0 . 1 5ab3 5 . 0 1 8＊＊

Fig.1　The relative protein expressions of ZO-1 and ROCK in Caco-2 cells图1　Caco-2细胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白相对表达量

Tab.3　The relative protein expression levels of ZO-1 and ROCK at different time points in Caco-2 cells表3不同时间点Caco-2细胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白相对表达量　　（n=3,±s）

Tab.3　The relative protein expression levels of ZO-1 and ROCK at different time points in Caco-2 cells表3不同时间点Caco-2细胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白相对表达量　　（n=3,±s）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与L组比较，P＜0.05

组别C组H组L组HL组F ZO-1蛋白相对表达量6 h 1.00±0.08 0.99±0.10 0.53±0.07a0.65±0.10ab21.126＊＊12 h 1.00±0.09 1.01±0.10 0.45±0.12a0.70±0.10ab19.684＊＊24 h 1.00±0.05 0.96±0.07 0.41±0.08a0.77±0.08ab45.472＊＊组别C组H组L组HL组F ROCK蛋白相对表达量6 h 1.00±0.08 1.03±0.08 1.33±0.07a1.16±0.09ab10.240＊＊12 h 1.00±0.11 0.91±0.10 1.48±0.08a1.22±0.07ab22.437＊＊24 h 1.00±0.11 1.05±0.11 1.56±0.13a1.24±0.09ab15.812＊＊

3　讨论

TEER和FITC-右旋糖酐通过率是常用的检测Caco-2细胞单层屏障功能变化的敏感指标，TEER值主要反映了肠屏障模型离子通透性的改变，而FITC-右旋糖酐通过率则反映了大分子物质透过肠屏障模型的能力。不同实验条件和不同克隆Caco-2细胞测得的TEER值差别较大，可从500～1 500 Ω·cm2不等［6］。本实验中建立的Caco-2细胞单层模型TEER值均达到800 Ω·cm2，可完全满足实验的要求。

相邻肠上皮细胞间紧密连接蛋白相互连接，在细胞的顶端形成环状带，控制物质从细胞旁途径跨越肠上皮的移动。ZO-1是第一个被分离出来的紧密连接蛋白，其连接于其他紧密连接蛋白和细胞骨架蛋白之间，调节细胞间连接和细胞旁通透性［7］。ROCK于20世纪90年代被分离出来，广泛分布于各组织器官，有2种亚型：ROCK1和ROCK2。ROCK主要通过调节细胞骨架影响细胞的生命活动［4］。Y-27632是ROCK的特异性抑制剂，对ROCK1和ROCK2均有抑制作用。有文献报道，ZO-1蛋白与细胞中的肌动蛋白丝相连［7］，而ROCK也可通过调节细胞内肌动蛋白丝的聚集与解离使细胞骨架重组，连接旁肌动球蛋白环（perijunctional actomyosin ring，PAMR）收缩，增加肠上皮的通透性［8］。Van Itallie等［9］发现ROCK可通过影响ZO-1蛋白改变肠屏障的功能状态。Mirza等［10］认为ROCK通过使致病性酵母菌诱导的Caco-2细胞的肌动蛋白细胞骨架重组和ZO-1蛋白丢失，进而增加肠上皮通透性。本实验结果表明，LPS可诱导Caco-2细胞ROCK mRNA表达增高，ROCK蛋白表达上调，降低ZO-1 mRNA和蛋白的表达水平。而ROCK抑制剂Y-27632可有效改善Caco-2单层细胞脓毒症模型的完整性和通透性，缓解LPS引起的Caco-2细胞ZO-1 mRNA表达下调，与本课题组的在体研究结果一致［11］。因此本实验表明，ROCK参与了LPS诱导的Caco-2细胞脓毒症模型中ZO-1蛋白的表达改变，抑制ROCK过度表达可改善离体肠屏障模型的功能状态。

氢气是一种选择性抗氧化剂，对多种疾病具有治疗作用［12］，但其治疗机制尚不清楚；由于其安全温和、易透过生物膜等优点［13］，在临床上有广阔的应用前景。本课题组前期研究发现，氢气能有效改善脓毒症肠屏障功能障碍［3］。本实验研究显示氢气可改善Caco-2细胞脓毒症肠屏障模型的完整性和通透性，抑制细胞内ROCK过度表达，增加ZO-1蛋白表达。结合上述实验结论，可推测氢气可能通过ROCK改善离体脓毒症肠屏障的功能状态。然而氢气治疗作用广泛，对多种疾病都有治疗作用，也有文献报道氢气的治疗作用可能通过其他作用靶点实现［6，13］。因此推测，氢气可通过多种途径调节保护脓毒症肠屏障功能状态，ROCK可能参与了氢气的保护机制，而氢气对脓毒症肠屏障复杂的保护机制仍有待研究。

综上所述，氢气可保护脓毒症肠屏障功能，改善肠上皮屏障完整性和通透性，增加肠细胞间紧密连接蛋白表达，这些保护机制可能与氢气抑制LPS诱导的ROCK过度表达有关。

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（2016-01-21收稿2016-03-10修回）

（本文编辑李国琪）

中图分类号:R364.5

文献标志码：A

DOI:10.11958/20160025

The role of Rho kinase in the protective effects of hydrogen on the damage of Caco-2 epithelial barrier induced by LPS

MA Xiaoye1,YU Yang1,ZHANG Hongtao1,XIE Keliang1,2,YU Yonghao1,2△
1 Department of Anesthesiology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;
2 Tianjin Institute of Anesthesiology
△Corresponding AuthorE-mail:yuyonghao@126.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of Rho kinase(ROCK)in the protective effects of hydrogen on intestinal epithelial barrier function in sepsis.MethodsCaco-2 cells were cultured routinely,and divided into 6 groups randomly(n= 3):control group(C group),hydrogen-rich medium group(H group),lipopolysaccharide(LPS)-treatment group(L group),hy⁃drogen+LPS-treatment group(HL group),Rho kinase inhibitor(Y-37632)treatment group(Y group)and Rho kinase inhibi⁃tor Y-27632+LPS-treatment group(YL group).H group was treated with 0.6 mmol/L hydrogen-rich media.The concentra⁃tion of LPS and Y-27632 were 50 mg/L and 25 μmol/L separately.After the Caco-2 monolayer model was established,the transepithelial electrical resistance(TEER)values were measured regularly.When the TEER value reached 800 Ω·cm2,the treatment was administered.Then TEER values were measured at 6 h,12 h and 24 h,and FITC-dextran permeability was de⁃tected at 24 h.Cells were seeded on 6-well plates.After cell density reached 80%-90%,treatments were given randomly. The real time-polymerase chain reaction(RT-PCR)was conducted to assess mRNA levels of ZO-1 and ROCK mRNA.ZO-1 and ROCK protein expression levels were detected by Western blot assay.ResultsCompared with C group,TEER values were elevated in 12 h and 24 h in H group(P<0.05).There were no statistical significances in FITC-dextran permeability,protein expression levels of ZO-1 and ROCK between C group and H group(P>0.05).TEER values were elevated at 6 h,12 h and 24 h in Y group(P<0.05).There was no significant difference in FITC-dextran permeability between C group and Y group(P>0.05).The mRNA expression of ZO-1 increased and mRNA expression of ROCK decreased in Y group(P< 0.05).The TEER values reduced at 6 h,12 h and 24 h in L group.The FITC-dextran permeability increased significantly, mRNA and protein expressions of ZO-1 significantly decreased,mRNA and protein expressions of ROCK significantly in⁃creased in L group(all P<0.05).Compared with L group,TEER values increased significantly at 6 h,12 h and 24 h in YL group,FITC-dextran permeability decreased,mRNA expressions of ZO-1 increased,mRNA expressions of ROCK de⁃creased in YL group(P<0.05).Compared with L group,TEER values increased at 6 h,12 h and 24 h in HL group,FITC-dextran permeability reduced markedly,protein expressions of ZO-1 increased at each time point,protein expressions of ROCK decreased at each time point in HL group(P<0.05).ConclusionHydrogen can protect intestinal barrier function against sepsis,ameliorate the integrity and permeability of intestinal epithelium and increase the expressions of intercellular tight junction proteins.The suppression of Rho kinase over-expression induced by LPS may be involved in these protective effects of hydrogen.

Key words:rho-associated kinases;hydrogen;lipopolysaccharides;sepsis;Caco-2 cells;intestinal epithelial barrier function脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征（SIRS）。脓毒症常继发于创伤、大手术等引发的严重感染，可发生于各年龄段的患者。脓毒症发生率、病死率高，在美国，每年因脓毒症死亡人数约占总死亡人数的10%，是重症监护室（ICU）患者的第二大死因，幸存者也常因为并发症和后遗症而导致生活质量严重下降［1］。肠屏障一直被认为是脓毒症的“motor”［2］，其构成错综复杂，在脓毒症的发生发展中扮演了重要的角色，是脓毒症治疗的研究热点。肠道细胞间的紧密连接使相邻肠细胞紧密锚定、相互沟通，与肠细胞共同构成了肠上皮的机械屏障。近年来研究显示，氢气对多种疾病具有治疗作用，本课题组前期研究显示，氢气在脓毒症模型中对肠屏障具有保护作用［3］，然而具体作用机制并不明确。Rho激酶（ROCK）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞内生命活动，可对细胞骨架蛋白起到调节作用［4］。研究发现，ROCK可以通过调节肠上皮细胞间紧密连接蛋白进而影响肠屏障通透性［5］。本实验旨在探讨ROCK在氢气对脓毒症肠屏障保护中的作用机制。