我国GII.4型诺如病毒Sydney株P颗粒的表达及其组织血型抗原结合特征

张　婷,龙　艳,张绪富,胡贵方，戴迎春



我国GII.4型诺如病毒Sydney株P颗粒的表达及其组织血型抗原结合特征

张婷1,龙艳2,张绪富2,胡贵方1，戴迎春1

1.南方医科大学公共卫生与热带医学学院，广州510515；2.南方医科大学中医药学院，广州510515

摘要：目的表达我国新发现GII.4型诺如病毒优势流行株—Sydney株的P颗粒，并探究其结合人类组织血型抗原(HBGAs)受体特征及变化规律。方法扩增SH 2012_05株中的P区域序列，构建进化树分析其氨基酸序列，并在原核表达系统中表达P颗粒。目的重组蛋白经Western blot确定其特异性，并采用ELISA法检测P颗粒结合HBGAs的能力及方式。结果SH 2012_05毒株 P区域与Sydney/2012原型株同源性为99.1%，为GII.4/Sydney基因簇。SDS-PAGE电泳和Western blot分析验证SH 2012_05株P颗粒具有特异性。其结合HBGAs受体方式与以往流行的基因簇一致，即与A、B、O、AB型分泌型唾液均能结合，其中与B型抗原亲和力最高。结论成功表达了我国新发现GII.4型诺如病毒Sydney株的P颗粒，明确了Sydney株能结合分泌型HBGAs受体的特征。本研究为诺如病毒疫苗株选择提供了技术储备，这将为GII.4型诺如病毒的预防和控制提供科学基础。

关键词：诺如病毒；GII.4型；Sydeny株；P颗粒；人类组织血型抗原

Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 81473402), the Nature Science Foundation of Guangdong Province (No. 2014A030313332), and the 10th Presidential Foundation of School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University (No. GW201503)

Correspondence authors:Hu Gui-fang,Email:guif-hu@sina.com；Dai Ying-chun, Email: yingchun78@hotmail.com.

诺如病毒(Norovirus, NoV)具有基因多样性，分为5个不同的基因型GI-GV，其中GII.4型是全球优势流行株，每隔1～3年就有新的GII.4变异株出现，包括95/96US株(1995-1996年)、Farmington Hills株(2002-2004年)、Hunter株(2004-2006年)、2006a株和2006b株、Osaka株(2007年)New Orleans株(2009年)和Sydney株(2012年)。NoV以株别特异性的方式识别人组织血型抗原(Histo-blood antigens,HBGAs)[1-2],HBGAs是一类复合糖，不仅存在于血细胞、肠道粘膜细胞表面，也以游离的形式存在于乳汁、唾液中。NoV与HBGAs抗原结合模式主要分为3组：H抗原、A/B抗原和Lewis抗原结合模式[3-4]。

自2012年9月起，欧洲NoV监测网络发现全球NoV胃肠炎患者呈现大幅度上升，经过后期基因分析证实，NoV胃肠炎的暴发增加与一种新型GII.4型变异株有关，该变异株被命名为Sydney株。GII.4型Sydney变异株首先在丹麦等地的散发病例中发现，随后引起疫情暴发造成世界范围内的大流行[5]。2012年底至2013年初，我国北京、香港、广州、江苏省等地区均有GII.4型Sydney株的流行[6-9]。本研究表达了NoV Sydney株的受体结合区(P区域)并制备P颗粒，研究了Sydney株P颗粒与HBGAs之间的结合模式，确定其感染的宿主范围，为丰富我国GII.4型诺如病毒进化规律及GII.4型诺如病毒的预防和控制提供科学基础。

1材料与方法

1.1病毒株和唾液标本GII.4型NoV SH 2012_05株来自上海市金山区疾病预防控制中心2012年的腹泻样本[11]，唾液标本为本研究室保存，HBGAs表型已明确[12]。

1.2试剂Roche(罗氏)病毒RNA提取试剂盒，QIAGEN OneStep RT-PCR Kit、Takara高保真酶、感受态细胞Top10及BL21购自TIANGEN,CloneJET PCR Cloning Kit、小量质粒提取试剂盒和琼脂糖切胶回收试剂盒购自Thermo Scientific公司，限制性内切酶BamHI和NotI购自Fermentas公司，GST-Resin购自上海七海复泰生物科技有限公司，Thrombin酶购自GE公司，表达载体PGEX-4T-1为本实验室保存。

1.3病毒核酸提取采用PBS液(pH=7.4)将粪便样本制备成10%的悬液,按照罗氏病毒RNA提取试剂盒的说明操作提取RNA样本，-80 ℃保存。1.4SH 2012_05株P区域基因克隆根据GII.4/Sydney株ORF2序列设计扩增P区域的特异性引物Sydney F/R，如表1所示。以上述提取的病毒株SH 2012_05 RNA为模板，RT-PCR反应参数：50 ℃逆转30 min；95 ℃预变性15 min；94 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃延伸10 min，扩增条带大小约1 kb。将PCR产物连接到T-easy载体上，通过测序进行鉴定，根据测序结果，利用Mega 6.0软件，选取具有代表性的NoV GI和GII型参考株共16株构建NoV P区域的进化树，采用Clustal W和Neighbor-joining法进行比对和构建。

表1GII.4型NoV Sydney株P区基因片段扩增所用引物

Tab.1Primers used for the P region genes of GII.4 NoV Sydney

PrimerSequence(5'-3')SydneyFTCAAGAACTAAACCATTCTCSydneyRTTATAGTGCACGTCTACGCSydney(p)FGCACGGATCCTCAAGAACTAAACCAT-TCTCSydney(p)RGCATGCGGCCGCTTAGCAAAAG-CAATCGCCACGGCAATCGCATAGTG-CACGTCTACGC

1.5重组P颗粒表达载体构建设计的扩增P区的特异性引物，其上下游引物中分别引入BamHI和NotI限制性内切酶酶切位点，并在下游引物C末端加入CDCRGDCFC修饰氨基酸序列以促进P颗粒的形成[13]，粗体标记为限制性内切酶酶切位点BamHI和NotI，斜体标记为CDCRGDCFC修饰氨基酸序列，见表1。以SH 2012_05株RNA为模板进行RT-PCR扩增，将扩增产物连接到T-easy载体上。重组P区域克隆和表达载体PGEX-4T-1分别用BamHI和NotI双酶切，将产物进行回收纯化后连接并将连接产物转化至TOP10感受态细菌。通过酶切和测序确定重组质粒中插入的序列。

1.6SH 2012_05株P颗粒制备经鉴定的重组质粒转化到BL21(DE3)进行原核表达，通过SDS-PAGE电泳鉴定重组融合蛋白。利用GST蛋白琼脂糖4B亲和纯化柱对重组融合蛋白纯化，纯化后利用凝血酶除去融合蛋白的标签部分。将纯化的目的蛋白洗脱下来后用于Western blot鉴定和结合HBGAs受体的特性研究。

1.7P颗粒的Western blot鉴定分析取10 μL样品于SDS-PAGE凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜，膜依次用5 %脱脂奶封闭、鼠抗NoV多抗血清(1∶1 000)、羊抗鼠辣根过氧化物IgG(1∶3 000)孵育、PBST充分洗涤，最后HRP-DAB底物显色。

1.8ELISA法检测P颗粒与HBGAs受体的结合特性将唾液标本用PBS(pH=7.4)按1∶1 000稀释，包被于96孔酶联板(100 μL/孔)过夜，5 %脱脂奶封闭1 h，将SH 2012_05株和GII.4/2004株 (本实验室保存)P颗粒用PBS稀释成20 μg/mL，37 ℃孵育1 h，每孔加入鼠抗NoV多抗血清(1∶1 000)100 μL，37 ℃孵育1 h，再加入羊抗鼠辣根过氧化IgG(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，加入TMB避光显色10 min，最后加入2 mol H3PO4终止显色，酶标仪450 nm波长处测定OD值。

2结果

2.1P区域基因扩增及氨基酸序列进化树构建获得NoV P区域基因片段，大小为1 kb，片段连接至T-easy载体。进化树结果显示：SH 2012_05株和SH 2012_06株与GII.4型NoV参考株在同源性上达到88%～99.1%，与Sydeny/2012原型株同源性达到99.9%，且划分为同一分支，系统进化树见图1，结合氨基酸序列分析2012年上海市金山区NoV暴发现场分离的病毒株属于NoV新型变异株 GII.4/Sydeny/2012。

图1　NoV P区域氨基酸序列进化树构建Fig.1　Phylogenic tree of amino acid sequences of NoV P domain

2.2重组P颗粒表达载体的建立选用SH 2012_05株用于P颗粒的表达。重组质粒酶切电泳鉴定，1 %琼脂糖电泳酶切后的P区域片段和线性PGEX-4T-1载体，大小分别为1 kb和4.9 kb，证明已将SH 2012_05株 P区域成功导入表达载体PGEX-4T-1，完成了重组表达载体的构建。

注：M:蛋白分子量标准；1～4：P颗粒；5：GST-P融合蛋白M: Protein marker; 1-4: P particle; 5: GST-P fusion protein.图2　GST融合P颗粒大肠杆菌表达及P颗粒的纯化Fig.2　Production of P-GST fusion protein and purification of the P particle

2.3SH 2012_05株P颗粒的诱导表达根据SDS-PAGE电泳如图2所示，重组融合蛋白大小为63 kD，经凝血酶除去GST标签蛋白后，获得约为36 kD的目的蛋白，与预期P颗粒大小一致。为了进一步验证原核表达系统表达P颗粒的特异性，将SDS-PAGE凝胶分离的目的蛋白转印到PVDF膜上，经特异性抗体进行Western blot分析，在大小为36 kD位置显示条带见图3,证明了研究所用的原核表达系统BL21(DE3)表达的重组P颗粒具有特异性。2.4GII.4型 NoV Sydney株唾液结合模式SH 2012_05 Sydney株与唾液HBGAs的结合模式，如图4所示SH 2012_05株基因簇毒株与A、B、O、AB型分泌型唾液均能结合，其中结合B型抗原亲和力最高[4]；与非分泌型唾液不结合。

注：M：蛋白分子量标准；1：GST-P融合蛋白；2：P颗粒蛋白M: Protein marker; 1: GST-P fusion protein; 2: P particle.图3　重组SH 2012_05株P颗粒的Western blot印迹分析Fig.3　Western blot analysis of re-combinant P particle of SH 2012_05 strain

图4　Sydney株P颗粒与唾液HBGAs受体结合能力Fig.4　Binding activity of Sydney strain with HBGAs receptor

3讨论

NoV结构蛋白VP1是主要的抗原决定簇，研究表明在NoV P区域C末端加入CDCRGDCFC修饰氨基酸序列可以促进P颗粒的形成。由于人类NoV至今尚不能在细胞中有效的培养，也没有合适的感染动物模型，作为候选亚单位疫苗的P颗粒[10]已同时成为研究NoV与受体结合模式研究的重要手段。

自20世纪90年代确认GII.4 型NoV导致绝大部分NoV胃肠炎暴发以来，GII.4一直为全球优势流行株。其传染性强极易引起暴发流行，带来了沉重的疾病负担。2012年底，新出现的GII.4/2012基因簇(代表株Sydney株)，亦蔓延至欧美、亚洲造成新一轮的世界大流行，已至少造成几百万人感染。GII.4型NoV的疫苗研究是预防和控制NoV的重要手段，其疫苗株的选择和储备是当前研究的热点。本研究成功的表达了Sydney株的P颗粒，为疫苗株的选择及亚单位疫苗研制开发提供了技术储备。

GII.4型NoV每隔2～3年形成新的基因簇，并导致新一轮的全球流行。其进化的分子机制对于理解NoV的流行病学，尤其是制定疫苗研制策略至关重要。目前，GII.4型NoV的分子进化机制尚不明确，初步认为宿主受体识别、宿主免疫、序列空间及复制动力学这4个因素可能是影响其进化方向和速度的重要因素；其中宿主受体的识别机制及宿主免疫压力被认为是最主要因素[14-15]。

HBGAs是一类具有高度多态性的糖类抗原，广泛分布于红细胞、呼吸道，泌尿生殖和消化道粘膜上皮细胞表面。北美和欧洲人群中，分泌型人群约占80%，而中国人群中，分泌型的人群占80%～90%。近30年来，GII.4型一直是全球流行的主要病毒株，我们前期研究表达了除Sydney以外GII.4不同基因簇的P颗粒，结果表明1987-2012年近20年间不同基因簇P颗粒结合HBGAs的亲和力存在差异，但结合模式相似，即与A、B、O型分泌型结合，与非分泌型不结合[4,16]。本研究表达了我国的Sydney株P颗粒，与前期结果一致。Sydney株保持了GII.4能识别所有分泌型HBGA受体的能力，进一步表明了Sydeny株能广谱的易感宿主是成为新的世界流行株的重要原因之一。

本研究成功表达了我国新现GII.4 NoV优势流行株Sydney株，为我国进一步研制开发NoV疫苗提供了技术储备；研究进一步丰富了我国GII.4型NoV进化规律，这将为GII.4型诺如病毒的预防和控制提供科学基础。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.006

通讯作者：胡贵方，Email:guif-hu@sina.com；

中图分类号：R373.9

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)04-0344-05

收稿日期：2015-10-09修回日期：2016-01-23

Expression of NoV GII-4 Sydney strain P particle and analysis of its binding activity with HBGAs receptor in China

ZHANG Ting1, LONG Yan2, ZHANG Xu-fu2, HU Gui-fang1,DAI Ying-chun1

(1.DepartmentofEpidemiology,SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:There was a newly emerging predominant GII.4 norovirus, Sydney variants, in China. To explore its binding patterns with HBGAs receptor, we cloned the P domain genes of norovirus SH 2012_05 and constructed recombinant plasmid. After that we expressed P particle by prokaryotic system and determined its binding profile by using ELISA saliva method. Like former studies, results showed that SH 2012_05 P particle could bind to saliva of all kind of secretors, including A-group, B-group, AB-group, O-group, in which it showed stronger binding affinity to B-group. In the present study, technical reserve of P particle was stored as a choice for vaccine candidate, which provides a scientific basis to prevent and control GII.4 norovirus.

Keywords:norovirus; GII.4 genotype; Sydney strain; P particle; human histo-blood group antigen

国家自然科学基金 (No.81473402)；广东省自然科学基金(No.2014A030313332)和南方医科大学公共卫生与热带医学学院第十期院长基金(No.GW201503)联合资助

戴迎春，Email: yingchun78@hotmail.com