番茄黄化曲叶病毒辽宁葫芦岛分离物的检测和序列分析

杨彩霞, 张帅宗, 孙蓬蓬, 高　雅, 汪绪花， 王　喆

(沈阳大学生命科学与工程学院/辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁 沈阳 110044)



番茄黄化曲叶病毒辽宁葫芦岛分离物的检测和序列分析

杨彩霞, 张帅宗, 孙蓬蓬, 高雅, 汪绪花， 王喆

(沈阳大学生命科学与工程学院/辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁 沈阳 110044)

摘要:采用已报道的菜豆金色花叶病毒属的通用引物PA/PB，从辽宁葫芦岛地区的3份番茄样品中扩增到Begomoviruses的保守区域，获得3个长度约500 bp的克隆序列，同源性为99.58%.DNA-A全基因组序列分析结果显示，3份样品DNA-A全长均为2 781 bp(分别命名为LNhud1、LNhud2和LNhud3分离物)，具有典型双生病毒结构，与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)山东分离物(TYLCV-[CN:SD:SDWF-L7:12],KC999850)的核苷酸同源性最高(99.6%).根据双生病毒分类标准，认为LNhud1、LNhud2和LNhud3是TYLCV的辽宁分离物.系统关系树表明，这3个分离物属于TYLCV-Isreal株系.

关键词:菜豆金色花叶病毒属; 番茄黄化曲叶病毒; 辽宁; 序列分析

番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)属于双生病毒科(Geminivirade)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus).基因组含有一个(DNA-A)长约2.8 kb的单链环状DNA分子，由烟粉虱(Bemisiatabaci)以持久方式传播[1].该病毒最早发生在中东以及地中海地区[2]，近30年来，随着全球贸易的日益频繁和暴发性害虫烟粉虱入侵的加剧，TYLCV迅速扩散至世界各地，现已在美洲、欧洲、非洲和亚洲的数十个国家暴发流行，成为制约番茄生产的一种毁灭性病害[3-4].TYLCV不仅可引起番茄叶片黄化、向上或向下卷曲和植株矮化，甚至导致20%～100%的减产并严重影响番茄品质[5].

我国于1965年首次报道了广东番茄上发生粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒病[6]，但由于该病害当时没有造成大的危害，未能引起有关部门的足够重视.近年来，TYLCV病害有逐年加重的趋势，现已遍及广西、广东、海南、云南、福建、台湾、浙江、上海、江苏、湖北、陕西、安徽、四川、甘肃、新疆、河南、北京、河北、山东和辽宁等地，对我国番茄种植业造成了极其严重的损失[7-12].目前，在GenBank数据库上仅能检索到9条TYLCV辽宁分离物的序列，其在辽宁的发生和分布情况尚不明确.本文对采自辽宁葫芦岛的番茄病样中的TYLCV进行分离鉴定和分子特征分析，以期为丰富辽宁TYLCV资源库提供新资料.

1材料与方法

1.1毒源材料

2012年10月，于辽宁省葫芦岛市绥中县采集到表现典型曲叶症状的番茄叶片，保存于超低温冰箱备用.

1.2植物总DNA的提取和滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)

采用CTAB法[13]提取植物总DNA.采用TempliPhiTM Kit试剂盒(GE Healthcare UK Limited)，参照滚环扩增法[14]对番茄的总DNA进行扩增，将扩增产物稀释100倍后作为PCR模板.

1.3PCR扩增、克隆和测序

引物合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成.本研究中所用引物信息如下.(1)DNA-A：利用设计的通用引物PA/PB[15]扩增双生病毒基因组DNA-A的部分序列，约500 bp.根据500 bp序列设计引物TYLCV-FL-BamHI-F/R(GTGGGATCCACTTCTAAATG/TGGATCCCACATAGTGCA A G)扩增DNA-A全长.(2)DNA-B：利用通用引物PCRc1/PBL1v2040[16]扩增双生病毒DNA-B组分.(3)卫星DNAβ和DNA-1：分别利用通用引物Beta01/02[17]和UN101/102[18]扩增双生病毒伴随卫星DNAβ和DNA-1分子.PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收目的条带，纯化后克隆至pMD-18T载体[宝生物工程(大连)有限公司]，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序.

1.4序列分析

借助DNAStar软件(DNASTAR Inc.,Madison,USA)和DNAMAN version 6.0 (Lynnon Biosoft,Quebe Canada)进行数据处理.利用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在GenBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列.采用DNAStar中的ClustalW方法分析DNA-A核苷酸或氨基酸的相似性.采用Clustal_X version 1.83[19]进行完全比对后再用软件MEGA version 4.0[20]的临近法绘制进化树，设置Bootstrap值为1 000.用于DNA-A序列比较和进化树构建的双生病毒序列信息[21-22]见表1.

2结果与分析

2.1样品检测

利用PA/PB引物在3个样品中均扩增到约500 bp的特异性片断(图1A)，将这些片断克隆、测序后均显示为双生病毒DNA-A的非编码区(intergenic region，IR)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因的部分区域.利用全长基因组扩增引物TYLCV-FL-BamHI-F/R扩增，均得到约3.0 kb的片段(图1B)，克隆、测序后得到DNA-A全序列，分别命名为分离物LNhud1、LNhud2和LNhud3.

2.2DNA-A全序列特征

LNhud1-LNhud3分离物DNA-A全长均为2 781 bp(KJ140787-KJ140789)，同源性达99.2%.分子特征分析显示，它们编码6个开放阅读框 (open reading frame,ORFs)，其中病毒链编码AV1(CP,308～1084 nt)和AV2(movement protein, precoat, 148～498 nt)，互补链编码AC1(replication initiation protein, Rep, 1 542～2 615 nt)、AC2(transciption activator protein, TrAP, 1 226～1 633 nt)、AC3(replication enhancer, 1 081～1 485 nt)和AC4(possibly determining symptom expression, 2 171～2 464 nt).在基因AV2与ACl之间有313 nts(147～2 616 nt)的非编码区，又称基因间隔区(intergenic region,IR)，该区含有病毒转录和复制所需的各种顺式元件，包括9个核苷酸TAATATTAC(2～2 775 nt)的茎环结构和TATAbox(2 773～2 776 nt)等.

2.3辽宁TYLCV分离物与其他双生病毒的同源性分析

将LNhud1-LNhud3 DNA-A序列在Genebank中进行BLAST同源性检索，发现其与TYLCV的同源性较高，均高于95%.将LNhud1-LNhud3 DNA-A与国内外报道的TYLCV以及番茄上发生的其他种类双生病毒进行全序列同源性比较，结果表明，它们与TYLCV-Israel(TYLCV-IL)株系的各国分离物同源性均在97.7%以上.其中，与山东分离物(登录号：KC999850，KC852151，KC999847)的同源性最高，均为99.6%;与新疆分离物(登录号：JX456639)(99.5%)、河北分离物(登录号：KC702796，HM208334)(99.5%，98.8%)、北京分离物(登录号：GU983859)(99.0%)、辽宁分离物(登录号：KJ754189,KJ754188)(99.0%)、安徽分离物(登录号：FN650807)(98.9%)、浙江分离物(登录号：FN256256)(98.8%)、江苏分离物(登录号：FN256259)(98.8%)、河南分离物(登录号：JN990924)(98.8%)、天津分离物(登录号：GU563330)(98.5%)和陕西分离物(登录号：JN412854)(98.3%)的同源性也都高于98%;与非TYLCV的双生病毒的同源性均低于76.8%.

进一步比较这些病毒编码的各ORF氨基酸序列发现，与预测的LNhud1-LNhud3 ORF的氨基酸同源性最高的是中国山东分离物(登录号：KC852151，KC999847，KC999850).根据《国际病毒分类委员会第九次报告》[22]规定，粉虱传双生病毒DNA-A同源性高于89%时认为是同一个病毒的不同分离物，大于94%则认为是同一株系的不同变种.因此，LNhud1-LNhud3是TYLCV的辽宁分离物，且属于TYLCV-IL株系.

2.4辽宁TYLCV分离物与其他双生病毒的系统进化分析

从图2可以看出：TYLCV病毒的各个株系聚集成一大类，侵染番茄的其他种类双生病毒(TYLCCNV和TYLCGuV)聚集成第2类，而小麦矮缩病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)作为群外枝单独成第3类.在TYLCV的众多分离物中，LNhud1-LNhud3与TYLCV-IL株系中的山东分离物(登录号：KC999850，KC999847)、新疆分离物(登录号：JX456639)聚在一个分支上，说明LNhud1-LNhud3与这些分离物的进化关系较近.这与序列同源性比较结果相似.

3结论

近年来，在辽宁多地观察到TYLCV病害.本研究对辽宁省葫芦岛番茄上引起黄化曲叶病的病原进行分子鉴定，显示其为TYLCV的一个分离物，仅含有单组分DNA-A分子，不伴随卫星分子.对LNhud1-LNhud3和TYLCV的其他分离物进行同源性分析，结果表明，LNhud1-LNhud3与TYLCV-IL株系的所有中国分离物的同源性均高于98%，说明LNhud1-LNhud3属于TYLCV-IL株系.其中，LNhud1-TYLCV与来自山东潍坊的分离物TYLCV-[CN:SD:SDWFL7:12]的亲缘关系最近.辽宁葫芦岛与山东潍坊隔海相望，推测辽宁葫芦岛的病毒源可能是通过蔬菜、种苗的海上运输或烟粉虱的迁徙活动等途径传入.鉴于TYLCV有很强的环境适应能力和繁殖能力，笔者将继续在其他作物上对其展开调查研究.

参考文献

[1] NAVOT N, PICHERSK E, ZEIDAN M, et al.Tomatoyellowleafcurlvirus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component[J]. Virology, 1991,185(1):151-161.

[2] COHEN S, HARPAZ I. Periodic, rather than continual acquisition of a new tomato virus by its vector, the tobacco whitefly (BemisiatabaciGennadius)[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1964,7:155-166.

[3] MORIONES E, NAVAS-CASTILLO J.Tomatoyellowleafcurlvirus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide[J]. Virus Research, 2000,71(1/2):123-134.

[4] CZOSNEK H, LATERROT H. A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses[J]. Archives of Virology, 1997,142:1 391-1 406.

[5] 蔡健和,秦碧霞,朱桂宁,等.番茄黄化曲叶病毒病在广西爆发的原因和防治策略[J].中国蔬菜,2006(7):47-48.

[6] 柯冲,孙芥菲,范怀忠.番茄黄顶病的初步研究[J].植物保护学报,1965,4(1):103-106.

[7] 褚栋,侯丽霞,刘国霞.山东省局部地区番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定[J].山东农业科学,2010(2):13-15.

[8] 丁英娜,李世访,张升,等.新疆番茄黄化曲叶病毒检测及DNA-A基因组序列分析[J].植物保护,2013,39(3):51-55.

[9] 阮涛,杨会房,杨水英,等.分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒(TYLCD)分子特征[J].农业生物技术学报,2013,21(1):97-105.

[10] 张穗,王冬生,瞿培荣,等.上海市番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病的初步鉴定[J].上海农业学报,2006,22(3):126.

[11] 张万民,马辉,洪晓燕,等.辽宁省番茄黄化曲叶病毒病发生及粉虱种群演替情况[J].中国植物导刊,2012,32(7):27-28.

[12] 赵统敏,余文贵,周益军.江苏省番茄黄化曲叶病毒病(TYLCD)的发生与诊断初报[J].江苏农业学报,2007(6):654-655.

[13] XIE Y, ZHOU X P, LI Z H, et al. Identification of a novel DNA molecule associated with tobacco leaf curl virus[J]. Chinese Science Bull, 2002,47:1 273-1 276.

[14] HAILE D, KOBER S, JESKE H. Rolling circle amplification revolutionizes diagnosis and genomics of geminiviruses[J]. Journal of Virological Methods, 2006,135:9-16.

[15] ZHOU X P, XIE Y, ZHANG Z K. Molecular characterization of a distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan, China[J]. Archives of Virology, 2001,146:1 599-1 606.

[16] ROJAS M R, GILBERTSON R L, RUSSELL D R, et al. Use of degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly transmitted geminiviruses[J]. Plant Disease, 1993,77:340-347.

[17] ZHOU X P, XIE Y, PENG Y, et al.Malvastrumyellowveinvirus, a new begomovirus species associated with satellite DNA molecule[J]. Chinese Science Bull, 2003,48:2 205-2 209.

[18] BRIDDON R W, BULL S E, MANSOOR S, et al. Universal primers for the PCR-mediated amplification of DNA 1: a satellite-like molecule associated with begomovirus-DNA beta complexes[J]. Molecular Biotechnology, 2003,23(1):83-86.

[19] THOMPSON J D, GIBSON T J, PLEWNIAK F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997,25:4 876-4 882.

[20] TAMURA K, DUDLEY J, NEI M, et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007,24:1 596-1 599.

[21] FAUQUET C M, BRIDDON R W, BROWN J K, et al. Geminivirus strain demarcation and nomenclature[J]. Archives of Virology, 2008,153:783-821.

[22] KING A M, ADAMS M J, LEFKOWITZ E J. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[R]. Amsterdam, Netherlands: Elsevier, 2012.

(责任编辑:杨郁霞)

收稿日期：2015-07-19修回日期：2015-09-17

基金项目:辽宁省教育厅一般项目(L2015362);辽宁省自然科学基金(2015020806)；辽宁省博士科研启动基金(20121043);沈阳大学博士科研启动基金(2012365).

作者简介:杨彩霞(1980-),女,副教授,博士.研究方向:植物病毒学.Email:xueyang27@126.com.

中图分类号:S432.1

文献标识码:A

文章编号:1671-5470(2016)04-0376-05

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.04.003

Detection and sequence analysis on isolates ofTomatoyellowleafcurlvirusin Huludao, Liaoning Province

YANG Caixia, ZHANG Shuaizong, SUN Pengpeng, GAO Ya, WANG Xuhua, WANG Zhe

(College of Life Science and Engineering/Liaoning Key Laboratory of Urban Integrated Pest Management and Ecological Security, Shenyang University, Shenyang, Liaoning 110044, China)

Abstract:Universal degenerate primers PA/PB were used to detect Begomoviruses from 3 types of tomato plants showing leaf curling symptoms in Huludao City, Liaoning Province, China. An approximately 500 bp fragments were amplified from each source of samples, and 99.58% sequence identity among partial DNA-A fragments confirmed that all three samples were infected by the same virus. Subsequent complete genome sequence analysis showed that DNA-A full length of all three isolates was 2 781 bp and were in the same genomic structure with begomoviral DNA-A. Three isolates were tentatively named LNhud1, LNhud2 and LNhud3, respectively. Basing on 99.6% nucleotide sequence identity, three isolates were most closely related to isolate of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV-[CN:SD:SDWF-L7:12], KC999850) from Shandong Province of China. Referring to demarcation criteria for identifying begomovirus species, LNhud1, LNhud2 and LNhud3 were considered as isolates of TYLCV and belonged to TYLCV-Isreal strain according to phylogenic analysis.

Key words:Begomovirus; Tomato yellow leaf curl virus; Liaoning; sequence analysis