盐酸小檗碱对MCF-7乳腺癌小鼠体内抑制肿瘤生长的实验研究

曾智豪，　陈小伍　朱达坚，　罗仲燃，　杨　敏

(南方医科大学附属顺德第一人民医院，　广东　顺德　528300)



盐酸小檗碱对MCF-7乳腺癌小鼠体内抑制肿瘤生长的实验研究

曾智豪，陈小伍朱达坚，罗仲燃，杨敏

(南方医科大学附属顺德第一人民医院，广东顺德528300)

【摘要】目的：研究盐酸小檗碱对MCF-7乳腺癌小鼠体内产生的作用与影响，为其临床应用建立理论基础。方法：建立人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠肿瘤模型，采用随机分组方法分为对照组，治疗组与阳性对照组，其中A为对照组，B为小檗碱治疗组(再以10、20、25mg/kg的不同剂量分为B1，B2，B3组)，C为多西他赛阳性对照组。每组共8只小鼠，采用皮下异种移植肿瘤小鼠模型对盐酸小檗碱的抗肿瘤疗效进行评价，评价内容包括鼠瘤体积变化以及肿瘤抑制率。结果：给药结束后，从鼠瘤体积变化来看，三组治疗组的情况均优于对照组，其中应用25mg/kg的B3组的情况最好，鼠瘤体积仅为(451.57±6.20)mm3。而在肿瘤抑制率方面，小檗碱三种剂量治疗组和阳性对照组的TGI值分别是5.55%、4.91%、58.88%、67.72%；相对肿瘤增殖率(T/C)%值分别为96.25%、92.29%、51.23%、44.08%，差异具有统计学意义。结论：小檗碱在人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠肿瘤模型中具有较好的抑制肿瘤生长的作用，且呈良好的剂量依赖性。

【关键词】小檗碱；乳腺癌；MCF-7

小檗碱，又名黄连素，是一种常见的异喹啉类生物碱，临床上主要用于肠道感染的治疗。目前一些研究认为，小檗碱对多种肿瘤均有不同程度的抑制作用，并有体外实验证明[1]，小檗碱能明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，其抑制率与药物浓度和作用时间呈依赖关系。本研究通过体内试验来观察小檗碱抗乳腺癌的作用。

1材料与方法

1.1试剂及设备:试剂：盐酸小檗碱(Sigma，0713-9977)；MEM细胞培养液(Gibco,批号：1621365)；胎牛血清(INVITROGEN；批号：1565565)；青霉素链霉素(Hyclone；批号：J122331)；人乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC)；多西他赛(LC Laboratories，批号：114977-28-5)羧甲基纤维素(Sigma，批号：BCBN1024N),吐温80(Sigma，批号：MKBG9019V)。主要设备：电子天平(上海光正，YP1102)；德国Sigma高速冷冻离心机(Sigma 3-30K)。光学显微镜(OLYMPUS，DP71)。

1.2动物:BALB/C裸鼠由上海大学生命科学院提供。合格证：SCXK(沪)2014-0005，均为雌性，饲养于SPF级别环境中，重量18～22g，6周龄，动物房温度23～25℃，湿度保持40～60%。

1.3细胞培养、肿瘤接种:实验鼠给予雌激素片(0.5mg,60day srelease)接种于皮下。MCF-7细胞体外悬浮培养，培养条件为MEM培养基中加10%热灭活胎牛血清，100U/mL青霉素及100U/mL链霉素37℃ 5% CO2培养。一周两次传代处理。当细胞呈指数生长期时，收取细胞，计数，接种。将含1×107个MCF-7细胞的0.2mL细胞悬液(细胞悬于MEM基础培养基:基质胶=100μL:100μL)皮下接种于每只小鼠的右后背。肿瘤平均体积达到145.32(100～200)mm3时开始分组给药。

1.4动物分组与给药方案:小鼠随机进行分组，分为溶剂对照组(A)、治疗组(B)，B组以10、20、25mg/kg的不同剂量分为B1，B2，B3组，C组为阳性对照组，应用多西他赛。具体给药方式见下表：

表1　动物实验分组和给药方案

注：空白对照组(A)配置方法为0.5% CMC-Na+0.2%吐温80

1.5实验动物日常观察:每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察药物对动物日常行为表现的影响，如行为活动，摄食摄水量，体重变化(每周测量两次体重或每隔1d测量)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物数量记录组内动物死亡数和副作用。

1.6实验指标:考察肿瘤生长是否可以被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V=0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。盐酸小檗碱的抑瘤疗效用TGI(%)来评价。TGI(%)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(%)的计算：TGI(%)=[1-(处理组给药结束时瘤体积-处理组给药开始时瘤体积)/(溶剂对照组给药结束时瘤体积-溶剂对照组给药开始时瘤体积)]×100%。TGI≥58%认为此药有效；TGI≥90%，认为此药极有效。

1.7统计分析:用SPSS17.0，进行所有数据分析，包括t检验，重复测量方差分析。

2结果

2.1各组小鼠21d中的体重变化:各组大鼠用药后的体重变化如下表所示，每组大鼠在第21天时的体重均比第1天有所下降，其中C组的大鼠的体重在第21天时较其余组下降的更多，对各组进行了重复测量方差分析，具有统计学差异，见表2。

表2　实验期间各组大鼠体重记录(g)

P*<0.001

2.2各组MCF-7乳腺癌鼠瘤体积变化:给药过程中，给药组动物的一般情况和进食量与阴性对照组差别无统计学意义，试验结果见表2。可见不同剂量的盐酸小檗碱对乳腺癌瘤体具有不同的抑制作用。

表2　实验期间各组鼠瘤体积的变化比较(mm3)

从鼠瘤体积变化来看，A组对照组的小鼠在21d时已经达到(881.48±17.12)mm3，B3组的小鼠在第21天瘤体积为(451.57±6.20)mm3，C组阳性对照组21d小鼠的瘤体积为(388.62±4.54)mm3。在第21天，B3组与B两组相比较差异有统计学，而B3组与C组比差异有统计学意义。

图1　试验期间各组鼠体重变化示意图

注：C组(阳性对照组)于第10天，第15天，第16天分别有一只小鼠死亡。

图2　实验期间各组鼠瘤体积的变化比较图示

2.3肿瘤抑制率：给药结束后(第22天)，小檗碱B1、B2、B3治疗组和阳性对照组的TGI值分别是5.55%、4.91%、58.88%、67.72%；相对肿瘤增殖率(T/C)%值分别为96.25%、92.29%、51.23%、44.08%。

图3　A组与B3组的肿瘤组织照片

在第23天，对实验小鼠进行安乐死，取瘤称重并拍照，从照片中可以看到B3组小鼠的肿瘤组织要明显小于对照A组小鼠的肿瘤组织。

3讨论

小檗碱是中药黄连的主要有效成分，早在20世纪70年代就已有日本学者提出小檗碱及其类似物具有抗肿瘤活性[2]。由于该药价格低廉、来源广泛、不良反应少等特点近年来其抗肿瘤作用而备受关注。文献报道，盐酸小檗碱在体外可显著抑制多种肿瘤细胞如前列腺癌[3]、白血病[4]、胃癌[5]、乳腺癌。而对于乳腺癌关于其体内研究尚未见报道，本研究希望通过体内试验来观察小檗碱抗乳腺癌的作用并分析其机制。

在本实验中，分别应用了小檗碱10、20、25mg/kg的三种剂量作为治疗组与对照组进行皮下异种移植肿瘤模型的抗肿瘤药效比较，而常用的乳腺癌治疗药物多西他赛作为阳性对照组。本次实验的给药周期为21d，采用腹腔注射的方法。给药期间阳性对照组有一只受试小鼠在第8天时体重下降达到27.33%，依照动物福利指导原则，对其实施了安乐死。在给药结束后(第21天)，从鼠瘤体积变化来看，A组对照组的小鼠在21d已经达到(881.48±17.12)mm3，B1、B2的两组数据虽然较A组略好，但并无统计学差异。而应用25mg/kg的B3组第21天的数据显示其治疗情况优于对照组，鼠瘤体积为(451.57±6.20)mm3，与A组相比差异有统计学意义(P<0.001)，C组多西他赛作为阳性对照组的小鼠瘤体积在第21天优于其他各组，差异具有统计学意义。而在肿瘤抑制率方面，小檗碱三种剂量治疗组和阳性对照组的TGI值分别是5.55%、4.91%、58.88%、67.72%；相对肿瘤增殖率(T/C)%值分别为96.25%、92.29%、51.23%、44.08%，B3组表现出差异具有统计学意义。而从副反应来考虑，各组小鼠在治疗第21天时，C组多西他赛阳性对照组小鼠的体重降低，而另四组相似，差异具有统计学意义。从结果上看，给药结束时，小檗碱25mg/kg剂量的B3治疗组对MCF-7乳腺癌小鼠皮下移植瘤具有一定的抑制肿瘤生长的作用，且呈良好的剂量依赖性，这与一些体外实验的结果相似，虽然其疗效不如多西他赛，但其副作用显著优于多西他赛所在的阳性对照组。

【参考文献】

[1]赵小飞，毛婷婷.小檗碱抗乳腺癌机制研究进展[J].中国中医基础医学杂志,2015,21(1):114～116.

[2]山田阳城.黄连素的药理和药效[J].国外医学·植物药分册,1993,8(2):70～73.

[3]Mantena SK, Sharma SD, Kaiyar SK. Berberine, a natural product, induces G1-phase cell cycle arrest and caspase-3-dependent apoptosis in human prostate carcinoma cells[J].Molecular Cancer Therapeutics,2006,5:296～308.

[4]Lin CC, Lin SY, Chung JG, et al. Down-regulation of cyclin B1 and up-regulation of Wee1 by berberine promotes entry of leukemia cells into the G2/M-phase of the cell cycle[J].Anticancer Research,2006,26:1097～1104.

[5]Letasiova, Jantova S, Cipak L, et al. Berberine-antiproliferative activity in vitro and induction of apoptosis/necrosis of the U937and B16 cells[J].Cancer Lett,2005,239(2):254～262.

【基金项目】广东省医学科研基金资助，(编号：B2012050)

【通讯作者】陈小伍,Email：zhihaotsang@163.com

【文章编号】1006-6233(2016)06-0988-04

【文献标识码】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.041