青海省乌兰县鼠疫病原学分析及流行病学意义

李积成,祁美英,魏柏青,熊浩明,杨晓艳,靳　娟,金　泳,李　翔,赵小龙,代瑞霞



青海省乌兰县鼠疫病原学分析及流行病学意义

李积成,祁美英,魏柏青,熊浩明,杨晓艳,靳娟,金泳,李翔,赵小龙,代瑞霞

青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科,西宁811602

摘要：目的分析青海省乌兰县鼠疫菌株生物学特性及流行病学意义，为该地区的鼠疫防治提供科学依据。方法对1966—2011年青海省乌兰县分离的65株鼠疫菌株进行生化试验、毒力测定、毒力因子鉴定、质粒分析、鼠疫菌差异区段(Different Region，DFR)分型等研究。结果65株被试菌株生物型为古典型、生态型均为青藏高原型。菌株基因组型为8型、5型、1b型、37型、44型，主要基因组型为8型。携带3种质粒谱，83.08%(54/65)菌株携带分子质量为6×106、45×106、52×106的质粒谱。93.85%(61/65)的鼠疫菌具备4个毒力因子，96.97%(32/33) 的鼠疫菌为强毒菌。结论青海省乌兰县分离的鼠疫菌具备青藏高原鼠疫病原体特性, 鼠疫菌的毒力强，因此该地区的鼠疫防治工作不容松懈。

关键词：鼠疫；病原学；流行病学；乌兰县

乌兰县位于青海省中部，海西蒙古族藏族自治州和柴达木盆地东部,海拔2 725～5 031米，总面积1.2万km2，人口10.1万人，辖铜普乡、赛什克乡、柯柯镇、希里沟镇、茶卡镇。乌兰县交通发达，青藏铁路、青藏公路、青新公路横穿县境。自1966年首次从喜马拉雅旱獭体内分离出鼠疫菌，证实为鼠疫自然疫源地。到目前为止，疫点分布占全县面积的80%以上，人间鼠疫也时有发生。从1966年至今，乌兰县共发生人间鼠疫7起，发病7例，治愈5例，死亡2例。为全面了解该地区鼠疫菌的生物学特性及鼠疫流行规律，作者对1966—2011年青海省乌兰县境内分离的鼠疫菌进行病原学研究，旨在为制订该地区的鼠疫防治对策提供依据。现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1材料试验用鼠疫菌65株，系1966—2011年从乌兰县境内不同宿主及媒介体内分离的鼠疫菌。其中喜马拉雅旱獭44株，牧犬1株，患者及人尸3株，斧形盖蚤6株，谢氏山蚤4株，腹窦纤蚤深广亚种2株，草原硬蜱1株，血红扇头蜱2株，古北拟额虱2株。所有菌株均由青海省国家鼠疫菌种保藏中心提供。实验动物为昆明系小白鼠，清洁级，990只，体质量18～20 g，由青海省实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1细菌表型特征按常规方法进行鼠疫菌生化、糖醇类酵解试验、毒力因子等表型特征的研究，根据传统的鼠疫菌生态型6项指标进行鼠疫菌生态型分析[1]。

1.2.2毒力测定选取33株菌，将每株菌的37 ℃24 h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液，比浊后稀释为2×101、2×102、2×103、2×104、2×105、2×106个/mL菌悬液，分别取0.5 mL皮下注射于小白鼠鼷部，每组5只动物，分笼饲养观察14 d，动物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心组织进行细菌培养，以分离出鼠疫菌为特异性死亡，并计算半数致死量(LD50)。鼠疫菌株毒力等级分类，参照文献[1]。

1.2.3质粒分析参照文献[2]的方法进行，质粒DNA相对分子质量(Mr)的测定采用标准质粒对照法。

1.2.4鼠疫菌DNA的提取DNA提取按照经典的苯酚-氯仿混合抽提法进行[3]。

1.2.5细菌差异片段(different region，DFR)分型

用23对DFR(DFR01～DFR23)分型引物和1对PMT1质粒验证引物，同时检索中国鼠疫菌自然分离菌株的DFR分型数据库[3-4]，对被试菌株DNA进行分型验证，以82 009、620 024菌株DNA的等量混合物为阳性对照，同时设置阴性对照，引物序列及结果分析方法参见文献[3]。

2结果

2.1鼠疫菌生化特性被试的65株鼠疫菌均能分解阿胶糖、麦芽糖和甘油，不分解鼠李糖和密二糖，脱氮阳性， 65株鼠疫菌的生物型为古典型，生态型为青藏高原型。

2.2毒力因子被试65株菌均能产生Fl和PstI，60株具有VW抗原因子，另外5株则不能产生；Pgm+菌株占93.85%(61/65)、Pgm ±菌株占1.54%(1/65) 、Pgm-菌株占4.62%(3/65)。

2.3毒力测定被试的33株菌中有29株菌的LD50为1～99个菌，3株LD50为100～999个菌，均属于强毒菌；1株LD50大于10 000个菌，为弱毒菌。结果显示，96.97%(32/33) 的鼠疫菌为强毒菌。

2.4鼠疫菌质粒谱试验显示，携带相对分子质量为6×106、45×106、65×106质粒的菌株为3株，6×106、45×106、52×106的菌株为54株，6×106、23×106、45×106、65×106菌株为8株。

2.5鼠疫菌的基因分型采用23个DFR和1个PMT进行PCR扩增后显示，被试的65株鼠疫菌共发现有5个基因组型。其中8型52株，1b型9株，5型2株，37型1株，44型1株，主要基因组型为8型，均为青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地所特有的基因组型。见表1。

表1　23个DFR和PMT1在乌兰县65株鼠疫菌中的分布状态

注:“1”为检出, “0”为未检出

Note：“1”means PCR amplification showed positive；“O”means PCR amplification showed negative．

3讨论

本研究结果显示，青海省乌兰县境内分离的65株鼠疫菌的生物型为古典型，生态型为青藏高原型，有5个基因组型，分别为8型、1b、5型、37型、44型1株，其主要基因组型为8型。共携带3种质粒谱，83.08%(54/65)菌株携带分子质量为6×106、45×106、52×106的质粒谱。93.85%(61/65)的鼠疫菌

具备4个毒力因子，96.97%(32/33) 的鼠疫菌为强毒菌。表明该地区分离的鼠疫菌株具有青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地病原特性，鼠疫菌的毒力强，因此该地区的鼠疫防治工作不容松懈。

乌兰县是以旱獭为主要宿主的单宿主疫源地，旱獭4月下旬出蛰、10月下旬入蛰，旱獭检菌率高，检菌面积大[4]，其体外寄生蚤以斧形盖蚤和谢氏山蚤为主。1966—2011年乌兰县从动物间和人间鼠疫流行过程中分离65株鼠疫菌，说明该地区动物鼠疫流行十分活跃，并造成人间鼠疫流行。2004年10月，乌兰县发生两起人间鼠疫，均为接触染疫旱獭所致，并从患者、死者及家中查获的旱獭体内分离出鼠疫菌，且对这两起疫情进行流行病学调查过程中，发现捕食旱獭人员1 252人，旱獭皮张55张，獭爪3 000余只，这些情况的存在增加了该地区发生人间鼠疫的潜在威胁。

近年来，由于旱獭及其产品地下交易市场价格飙升，该地区部分农牧民受经济利益的驱使，私自进入疫源地猎捕旱獭并长途贩运旱獭及其制品的情况时有发生，捕獭地点甚至远至甘肃、新疆、西藏和青海省动物鼠疫流行高发的青南地区。另外，青藏铁路格拉段开通后，大量外来游客进入当地，增加了外来人员接触染疫动物的机会和感染鼠疫的可能性。因此，做好该地区的鼠疫防治工作显得非常重要。建议：①当地必须高度重视鼠疫防控工作，不断增加人、财、物投入力度，保证鼠疫防控工作正常开展。②加大宣传教育和健康促进工作力度，提高群众对鼠疫防控知识的知晓率。③加强动物间鼠疫疫情监测，严格按照《全国鼠疫监测方案》要求开展工作，掌握当地动物间鼠疫流行状况，对动物间鼠疫及时进行处理。④完善鼠疫疫情应急处理系统，一旦发生人间鼠疫，及时进行科学、规范、有序处置，防止疫情传播和蔓延。⑤加强各级卫生人员和专业技术人员业务培训，稳定专业队伍，提高防治水平。⑥做好交通检疫工作，严防鼠疫通过铁路、公路远距离传播。

参考文献：

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李敏，于晓涛，金丽霞，等．我国鼠疫菌大质粒的特性及其流行病学意义[J] . 中国地方病学杂志，1994，13(4)：223-225．

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.019

通讯作者：代瑞霞，Email:drx200907@163.com

Corresponding author:Dai Rui-xia, Email: drx200907@163.com

中图分类号：R378

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)02-0200-02

收稿日期：2015-05-05；修回日期:2015-09-12

Etiological research and epidemiological significance of Yersinia pestis in Wulan County, Qinghai Province, China

LI Ji-cheng,QI Mei-ying,WEI Bai-qing,XIONG Hao-ming,YANG Xiao-yan,JIN Juan,JIN Yong,LI Xiang,ZHAO Xiao-long,DAI Rui-xia

(Plague Prevention and Control Department, Qinghai InstituteforEndemicDiseasesPreventionandControl,Xining811602,China)

Abstract:We discussed the biological characteristics and epidemiological significance of Yersinia pestis in Wulan County, Qinghai Province, in order to provide scientific basis for plague prevention and control in this area. We chose 65 strains separated in Wulan County, Qinghai Province during 1966 to 2011 to conduct biochemical test, toxicity test, virulence factors evaluation, plasmid analysis and DFR genotype. Results showed that all the strains’ biovars were antique, the ecotype were Qinghai-Tibet Plateau. The strains’ genotype were genomovar8, genomovar5, genomovar1b, genomovar37 and genomovar44, and the genomovar8 was the main genomovar. The strains had three kinds of plasmid spectrum, and 83.08% (54/65) strains’ plasmid spectrum was 6×106, 45×106, and 52×106. The 93.85%(61/65) strains contained all the four virulence factors--Fl, PstI, VW and Pgm, and 96.97%(32/33) were velogenic strains. Strains separated in Wulan County, Qinghai Province had the characteristics of Qinghai-Tibet plateau plague’s pathogen, strains’ toxicity were strong.

Keywords:plague; etiology; epidemiology; Wulan County

国家自然科学基金(No.81160211)资助

Supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China (No. 81160211)