甜叶菊三倍体培育及其农艺性状分析

程晓紊，朱　平，崔广荣

(安徽科技学院　农学院，安徽　凤阳　233100)



甜叶菊三倍体培育及其农艺性状分析

程晓紊，朱平，崔广荣*

(安徽科技学院农学院，安徽凤阳233100)

摘要：目的与方法：利用人工诱导获的四倍体植株与二倍体植株进行杂交获得三倍体甜叶菊植株，并对其农艺性状进行比较分析。结果：气孔、染色体等细胞学鉴定结果表明，甜叶菊三倍体气孔大小介于二倍体与四倍体之间，染色体数为33(2n=33)，甜叶菊三倍体培育获得成功。田间农艺性状考察及糖苷测定结果显示，植株高度及叶产量与二倍体相近但高于四倍体；三倍体甜叶菊植株在叶片厚度、叶片长度、叶片宽度均大于二倍体而与四倍体接近；糖苷含量及糖苷成分与二倍体及四倍体也存在一定的差异。结论：三倍体甜叶菊在农艺性状及糖苷含量上具有自身特点，在生产上具有重要的潜在价值。

关键词：甜叶菊；三倍体培育；农艺性状

甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni )为菊科多年生草本植物，原产地为南美巴拉圭东北部地区，甜叶菊在世界范围内广为种植。甜叶菊是一种新型的天然甜味剂，叶片中的糖苷甜度是蔗糖的300倍，具有低热量，安全无毒，甜味适口的特点，还有一定的药理作用。许多研究表明甜叶菊糖苷具有降血糖、抗菌功效[1-2]，并且对患有肥胖症、心脏病、龋齿等都有很好的疗效[3-6]。随着甜菊糖苷在食品、饮料和医药行业得到广泛应用，甜叶菊越来越受到人们的欢迎和信赖。

甜叶菊为异花授粉植物，其品种有无性品种和有性品种之分。培育优质、高产无性品种是甜叶菊有性品种的重要补充，同时也能确保其种苗遗传上的一致性[7]。多倍体植株在生物学特性上具有形态上的巨大性、细胞内次生代谢物含量高等特性。国外开展甜叶菊多倍体育种研究较早，Valois[8]利用秋水仙素溶液浸泡种子成功获取甜叶菊多倍体植株，Shuichi等[9]以四倍体植株为母本，二倍体植株为父本，成功获取了部分有价值的三倍体植株[9-10]。近些年来，国内有关研究工作者也开展了一些甜叶菊多倍体培育的研究探索工作，利用秋水仙素进行甜叶菊离体化学诱变，获取了大量的甜叶菊四倍体植株[11-12]，而且对多倍体离体诱变技术体系进行了技术改进，提高了四倍体诱导效率[13]。但经田间种植比较研究发现诱变获取的当代甜叶菊四倍体植株表现并不如意，四倍体虽表现出叶片肥大、厚实，但植株相对矮小(尤其是植株生长前期)，生物学产量相对较低[13]，国内有关三倍体培育的研究尚未见报道。基于甜叶菊四倍体田间生物学性状表现不足及其三倍体展现的育种价值[9],本研究在前期成功培育甜叶菊四倍体基础上，利用四倍体植株与二倍体植株杂交，培育三倍体甜叶菊植株，通过农艺性状筛选获得三倍体优良品系植株，旨在培育高产、优质甜叶菊无性品种，也为进一步开展甜叶菊多倍体相关遗传学基础、糖苷合成变化的生理机制研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

试验材料二倍体甜叶菊是由安徽省蚌埠永生农业科技有限公司提供的甜叶菊二倍体株系，人工诱变的四倍体、四倍体与二倍体单株杂交后代植株。

1.2方法

1.2.1四倍体与二倍体杂交分别取四倍体植株、二倍体植株各20株，间行栽培，形成隔离杂交小区，分别从二倍体与四倍体植株上收获种子备用。随机抽取四倍体与二倍体杂交后代100个植株进行细胞学鉴定，其中来自于四倍体上和二倍体上所结种子长成的植株各为50株。

1.2.2气孔鉴定甜叶菊植株移栽生长2月后，于上午9～10点取成熟叶片，擦去叶片表面的污垢，并防止叶表水分蒸发，使气孔充分张开。用刀片轻轻割下叶片下表皮，再用镊子取下，用水制成临时的封片，放在显微镜下进行观察并拍摄照片。

1.2.3根尖染色体鉴定参照王波、崔广荣等方法[11]。

1.2.4农艺性状的考察在开花前一周内，每个品种分别采用小区取样法，在每个小区随机抽取5株具有代表性的、长势中等的植株，分别考察不同倍性甜叶菊的株高、叶长、叶宽、叶厚、茎粗、节长等主要农艺性状，数据取平均值。

1.2.5甜叶菊糖苷含量的测定参照朱吟吟、周凌方法[14]，由安徽蚌埠永生农业科技有限公司完成。

1.2.6数据处理数据处理采用DPS软件、EXCEL软件等进行处理、分析。

2结果与分析

2.1三倍体细胞学鉴定

2.1.1气孔观察及其与四倍体植株、二倍体植株比较二倍体、三倍体及四倍体植株气孔镜检结果如图1～3所示，其大小存在明显差异，四倍体及四倍体与二倍体杂交后代植株叶片的气孔大小差异尤为明显，气孔的数量也较二倍体植株少很多，四倍体叶片的气孔大小较来自四倍体与二倍体杂交后代植株叶片气孔大，但在气孔数量上差异并不明显。在多倍体育种中，根据气孔大小来进行鉴定倍性是一种常用的办法，气孔的变化可以作为鉴定多倍体的一个重要指标，由此可以初步判定来自二倍体与四倍体杂交种子长成的植株是否为三倍体。

图1二倍体气孔大小(5×10)

Fig.1. The size of stomata of diploid(5×10);

图2三倍体气孔大小(5×10)

Fig.2. The size of stomata of triploid(5×10);

图3四倍体气孔大小(5×10)

Fig.3. The size of stomata of tetraloid(5×10)

2.1.2根尖染色体数目观察已知二倍体甜叶菊的染色体数目为2n=2x=22[11]，由图5可见，由四倍体与二倍体杂交获得了三倍体植株，其染色体数介于二倍体与四倍体之间，可较为清晰地数出染色体数为33条。

图4二倍体染色体(10×40)

Fig.4The chromosome of diploid(10×40) (2n=2x=22)

图5三倍体倍体染色体(10×40)

Fig.5 The chromosome of triploid (10×40) (2n=2x=33)

图6四倍体染色体(10×40)

Fig.6The chromosome of tetraloid (10×40)(2n=2x=44)

2.1.3四倍体和二倍体杂交不同来源种子植株的三倍体状况比较从四倍体与二倍体杂交后收获种子的情况看，四倍体上收获的可育种子数量大大少于来自二倍体上所结的种子，从数量上看仅为二倍体上的1/5左右，四倍体表现出明显的育性差的特点。不仅如此，经细胞学鉴定发现，来自于四倍体与二倍体杂交种子后代植株的三倍体数目及其比例差异也较为明显，来自于四倍体植株(杂交母株)的种子长成的杂交后代植株全为三倍体，而来自于二倍体植株(杂交母株)种子长成的杂交后代植株中的三倍体50株材料仅检出4株，其比例还不到10%(见表1)。

表1　四倍体与二倍体来源种子重量及其三倍体数量比较

上述结果表明，甜叶菊二倍体经染色体加倍后，四倍体的育性较差，尤其是花粉的育性较差(相关研究结果另文发表)，也就是说四倍体植株上所结种子的花粉全部来源于二倍体，而二倍体植株上所结种子的花粉主要来自二倍体，极少数来自于四倍体。众所周知，纯合二倍体植物的四倍体几乎是不育或育性很低，由于甜叶菊是异花授粉植株，人们常常通过优良单株选择、扩大优良单株群体而实现杂交培育新品种，本试验所用的二倍体新品种材料正是这种类型的材料，因此，其四倍体尚表现出一定的育性。

2.2不同倍性植株农艺性状比较

表2　不同倍性甜叶菊植株农艺性状比较

注：同列不同小写字母表示5%差异显著水平(表3同)。Note：Small letters show significant difference atP<0.05 levels.

表2结果显示，三倍体与四倍体、二倍体间在农艺性状表现上存在一定的差异。甜叶菊植株随着染色体倍性的增加，其株高减小，但茎粗、叶长、叶宽、叶厚度、节间距却增加，二倍体与三、四倍体之间差异显著，不过三倍体与四倍体之间除了叶间距外，其它农艺性状差异并不显著，这在一定程度上提高了三倍体的生物学产量，表现出一定的育种目标潜能。此外，叶片的颜色也随着倍性的变化也发生了一定的变化，二倍体植株叶片淡绿，三倍体、四倍体植株叶片呈浓绿，见图8～9。

图7二倍体植株

Fig.7The plant of diploid;

图8三倍体植株

Fig.8The plant of triploid;

图9四倍体植株

Fig.9The plant of tetraloid

2.3不同倍性甜叶菊植株叶片糖苷含量比较及分析

表3　甜叶叶片糖苷含量比较

表3结果表明，不同倍性甜叶菊在糖苷含量及品质上存在明显的差异，与二倍体相比，除RA/(RA+ST)指标外，三倍体与四倍体的各项指标均表现出显著差异。综合来看，各种成分糖苷含量随倍性增加而增加，表现出多倍体的基本特征，即内含物合成量增加，体现出倍性育种的潜在价值。根据前人的研究结果，RA苷的味质是最接近蔗糖，甜度也最高的，而其他糖苷的味质都有后苦味或者强苦味，若产品中RA苷的含量高，产品的味质就会比含其他糖苷高的更好，甜味更纯正[9]。结合表2结果数据看，尽管三倍体RA含量没有四倍体含量高，但其生物学产量远高于四倍体，单位种植面积的糖苷收获量依然超出四倍体，通过大量的杂交选育，最终获得高产、优质的三倍体无性品种潜力巨大。

2.4甜叶菊主要性状间的相关性分析

对甜叶菊的主要数量性状间的相关系数测定结果如下表4。甜叶菊的各个农艺性状中，茎粗与叶长、叶宽、叶厚和节长均呈负相关关系，其中，茎粗与叶长、叶宽负相关显著；株高与茎粗呈正相关关系，但未达到显著水平；叶长、叶宽和叶厚呈显著正相关，相关系数分别高达0.679和0.897。

对于甜叶菊的品质指标，RA苷与茎粗、株高呈负相关，但远远没有达到显著水平，说明这两个农艺性状对RA苷的含量影响不大；与叶长、叶宽、叶厚和节长呈正相关关系，其中，与节长的相关系数高达0.664，达到显著水平。ST苷、总苷和RA/ST与各农艺性状间相关均不显著。ST与RA苷虽然呈负相关关系，但未达到显著水平，说明两者含量虽有此消彼长的趋势，但并不显著，这一点与杨文婷等[15]的研究结果是一致。

表4　甜叶菊主要数量性状的相关系数

3结论与讨论

通过四倍体与二倍体杂交，成功地培育出三倍体甜叶菊植株。细胞学鉴定表明，三倍体细胞染色体数为33条(2n=33),与二倍体相比，植株气孔大、茎杆粗壮、叶片大而厚实且呈深绿色，在许多农艺性状上与四倍体相似，但其生物学产量(单株叶片干重)却远高于四倍体，这与二倍体相近。

三倍体在糖苷含量及糖苷成分上介于二倍体与四倍体之间。四倍体与二倍体杂交后代中，来自四倍体母本的种子植株均为三倍体，而来自二倍体母本的种子植株近8%为三倍体，同时四倍体母本植株收获的种子量较二倍体母本植株收获的种子量要少很多，表明四倍体育性较差，特别是花粉的育性，因此，培育三倍体无性品种以二倍体为父本、四倍体为母本较为合适。三倍体植株优良的农艺性状展现了其重要的潜在育种价值。

农艺性状中节长、叶片对糖苷RA的影响达到显著水平，其他性状虽然均有影响，但未达到显著水平，而ST与各农艺性状的相关性均不显著，说明在高RA品种的选育上节长、叶片可以作为一个重要指标。

由于多倍体植株普遍具有植株形态巨大、叶片厚实、叶片数多、抗性强、细胞内次生代谢物含量更加丰富等特点，因此在植物育种上占有重要的地位，很多植物的多倍体育种成果已经在生产上得到了广泛的应用，如四倍体甜菜、八倍体小黑麦等生产实例已广为人知。但甜叶菊的四倍体植株在田间的生长表现却不理想，尽管其叶片、茎干、花等方面表现出多倍体的巨大性特点，但前期苗生长缓慢、植株相对矮小、叶数量较少，后期虽然在植株高度上与原二倍体差异缩小，但生物学产量(干叶产量)却较低，无法达到生产应用价值[11,13]。Shuichi等[9]的研究结果给甜叶菊多倍体育种带来了希望，也指明了甜叶菊倍性育种的方向。他们以二倍体为父本、四倍体为母本，不仅成功获取了42株三倍体植株，这些植株叶片、花、气孔等均较二倍体植株大，而且从中筛选出7株高RA(rebaudioside-A)糖苷含量的三倍体植株[9]，RA糖苷是甜菊糖的主要成分，甜度很高且口感最接近蔗糖。本试验研究虽然未能筛选出高糖苷含量的三倍体植株，但所获三倍体已经在农艺性状方面继承了部分二倍体和四倍体各自的优良性状，相信随着四倍体亲本基因型种类的不断丰富及杂交后代群体的扩大，定会筛选出高产、优质的三倍体无性新品种。

在甜叶菊传统育种方法上，通常是筛选出优良的单株亲本进行繁殖、杂交、筛选，从而获得优良的杂交新品种。由于甜叶菊为严格的异花授粉植物，自花授粉不结实，亲本自身从基因型上看也是杂合的，因而杂交后代新品种不同个体间的基因型实际上不可能是一致的，只是杂交后代所形成的新品种群体表现上优良而已——群体改良。因此，通过秋水仙素诱变所得到的四倍体实质上只能是异源多倍体或部分同源多倍体，四倍体尚有部分育性，但育性较差[8-9]，本试验结果也验证了这一结论。甜叶菊四倍体、三倍体细胞遗传特征及其对农艺性状表达的影响和对糖苷合成控制机理等问题尚有待于进一步深入研究。

甜叶菊的糖苷品质是由多个农艺性状因素共同决定的，明确各种农艺性状对营养品质的主次关系，对选育优良的甜叶菊品种具有重要的意义，同时也为甜叶菊的育种提供重要的依据。本研究测定了的不同倍性甜叶菊糖苷含量，并将初步判断的优良二倍体品种与其多倍体一起进行主要数量性状间的相关系数的测定，结果显示了农艺性状中只有节长、叶片对糖苷RA的影响达到显著水平，其他性状虽然均有影响，但未达到显著水平，而ST与各农艺性状的相关性均不显著，说明在高RA品种的选育上节长、叶片可以作为一个重要指标。

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(责任编辑：李孟良)

收稿日期：2016-02-18

基金项目：校企横向合作项目“甜叶菊新品种‘惠农一号’的繁育与推广”。

作者简介：程晓紊(1992-)，女，安徽省涡阳县人，在读硕士研究生，主要从事甜叶菊生物技术及育种应用研究；*通读作者：崔广荣，教授，E-mail:cuigr64@sina.com。

中图分类号：S566.9

文献标识码：A

文章编号：1673-8772(2016)03-0025-06

SteviaTriploid Breeding and Agronomic Traits Analysis

CHENG Xiao-wen, ZHU Ping, CUI Guang-rong*

(College of Agronomy，Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Abstract：Objective and mothods:The triploid plants of stevia were produced by mating diploid and tetraploid parents which were induced with colchicine treatments. And the agronomic traits of the triploid were compared with the diploid and tetraploid. Results: the results of cell identification showed that the size of the stomata of the triploid was between the diploid and the tetraploid, and the chromosome number of root tip cell was 33(2n=33). The stevia triploid breeding got success. The studies of agronomic traits and determining of glycoside contents indicated that the plant height and the quantity of leaf were similar to the diploid but higher than the tetraploid. The size and thickness of leaf were bigger than the diploid plant, but smaller the the tetraploid. Meanwhile, there were some differences in the contents and the quantity of glycoside in the triploid compared with their parents. Conclusion: the triploid characters of agronomic traits and glycoside contents showed its potential impotent value in production.

Key words:Stevia rebaudiana Bertoni; Triploid breeding; Agronomic traits