青蒿素减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究

2016-07-25 05:00沈秀珍方毅华
湖北科技学院学报(医学版) 2016年3期
关键词:自噬心肌缺血青蒿素

沈秀珍,王 凌,方毅华

(赤壁市人民医院心内科,湖北 赤壁 437300)



青蒿素减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究

沈秀珍,王凌,方毅华

(赤壁市人民医院心内科,湖北 赤壁 437300)

摘要:目的 探讨青蒿素是否可以通过调节自噬减轻心肌缺血再灌注(I/R)损伤以及可能的机制。方法 采用大鼠心肌I/R模型(缺血30min,再灌注4h),雄性SD大鼠30只随机分为3组:假手术组(SO组,n=10)、缺血再灌注组(I/R组,n=10)和青蒿素治疗组(A+I/R组,n=10,Arteannuin:25mg/kg,Tid,造模前1d灌胃)。检测心肌损伤标记物肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白I(cTnI);检测氧化应激水平(丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平;检测自噬蛋白beclin-1和LC3水平。结果 与SO组比较,I/R组可诱导心肌损伤标记物,氧化应激水平的增加和自噬的过度激活;与I/R组比较,青蒿素可显著的降低心肌损伤标记物的表达、氧化应激水平和自噬的过度激活。结论 ①青蒿素可以通过抑制过度自噬减轻心肌I/R损伤;②青蒿素可能通过抑制氧化应激,抑制再灌注阶段自噬过度激活。

关键词:青蒿素;自噬;氧化应激;心肌缺血;再灌注损伤

自噬是细胞在应激或不良状态下的一种自我保护过程,可以清除降解的蛋白质和损伤的细胞器。通常认为,自噬是细胞稳态的维护者,然而,过度的自噬也可以引起细胞死亡,称为自噬性程序性细胞死亡(程序性死亡共三种,另外两种为凋亡和坏死),这说明自噬对细胞的影响是多样的、复杂的。前期的研究证实[1,2],自噬是心肌缺血再灌注损伤的重要机制之一,它在损伤的起始和进展过程中都发挥了重要作用。

青蒿素是青蒿的活性成分,因其100%的抗疟性而受到世界的关注。近年的研究发现[3,4],青蒿素对多种疾病都有明显的抗炎和抗氧化应激的作用,包括心梗和心肌I/R损伤。炎症和氧化应激是导致自噬过度激活的重要因素[5],但青蒿素是否可以通过调节自噬减轻心肌I/R损伤,目前尚无研究,为验证上述假设我们进行了下述研究。

1材料与方法

1.1动物准备与分组30只成年雄性SD大鼠,购于武汉大学动物实验中心。于恒温、恒湿、明/暗交替(12h)的环境喂养48h。

大鼠缺血再灌注模型:2%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,ip)后,仰卧固定于鼠板,气管插管(频率:70bpm,吸呼比:1∶1.5,潮气量:3~4mL/100g)。胸骨左缘切口,暴露心脏,破心包膜;于左心耳下2~3mm处将前降支与一个中间带有凹槽的空心乳胶管一起结扎,结扎线下心肌变苍白表明缺血成功。缺血30min后,沿乳胶管凹槽剪断结扎线再灌注4h。再灌注4h后,2%戊巴比妥钠麻醉(20mg/kg,ip),颈静脉采血2mL,迅速剪下心脏,剪除多余部分留取心梗区(白色)和缺血区(白色附近5mm)用于检测。30只大鼠随机分为3组:假手术组(SO,n=10):仅插管、开胸、LAD下穿线但不结扎;缺血再灌注组(I/R,n=10):按照上面所述造模,缺血30min,再灌注4h;青蒿素治疗组(A+I/R,n=10):造模前1d青蒿素灌胃(25mg/kg,Tid),造模同I/R组。

1.2检测指标和方法

(1)分光光度法检测血清乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白I(cTnI),通过心肌损伤标记物(LDH、CK、cTnI)的表达水平反应心肌损伤情况。静脉采血后静置10min,待血液凝固后离心(3000r/min×15min),取血清。选用南京建成生物工程研究所试剂盒,严格按照说明操作检测LDH和CK。

(2)检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,通过检测MDA和SOD评价心肌组织氧自由基含量和脂质超氧化水平。检测方法如前所述,采用南京建成生物工程研究所的MDA和SOD试剂盒,严格按照说明操作。

(3)western blot法检测LC3和beclin-1,组织匀浆在PAGE胶中电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,1抗孵育过夜,包括LC3(1∶500稀释,sigma),beclin-1(1∶500稀释,Abcanm)和β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)。在相应的二抗孵育后,ECL显色,以其与β-actin的比值表示其相对表达量。

2结果

2.1血清LDH、CK和cTnI结果与SO组比较,I/R组中LDH、CK和cTnI水平明显升高(P均<0.05);A+I/R组中CK和cTnI水平明显增高(P均<0.05),LDH有增高趋势,但未达统计学差异(P>0.05)。与I/R组比较,A+I/R组中LDH、CK和cTnI水平明显降低(P均<0.05)。见表1。

表1 青蒿素对心肌损伤标记物的影响±s)

与SO组比较,*P<0.05;与I/R组比较,#P<0.05

2.2心肌组织MDA和SOD水平结果见表2。与SO组比较,I/R组中MDA表达明显升高,而SOD表达明显降低(P均<0.05)。与I/R组比较,A+I/R组中MDA表达明显下降,而SOD表达明显升高(P均<0.05)。

2.3心肌组织LC3与beclin-1水平结果见表2。与SO组比较,I/R组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明显升高(P均<0.05)。与I/R组比较,A+I/R组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明显降低(P均<0.05)。

表2 青蒿素对氧化应激和自噬的影响±s)

与SO组比较,*P<0.05;与I/R组比较,#P<0.05

3讨论

青蒿素是由我国专家最先从青蒿中提取的活性成分,因其100%的抗疟有效性而受到世界的关注。虽然对青蒿素抗炎作用的研究由来已久,但青蒿素与心血管疾病关系的研究却很少,且主要集中在心律失常[4,6]。Gu等[4,6]发现青蒿素可以通过抑制心梗后炎症反应,减轻心脏的自主神经重构和心脏电生理基质的损伤。Sun等[3]发现,在离体缺氧复氧模型中,青蒿素可以明显抑制氧自由基生成,增加脂质超氧化。本研究用在体I/R模型进一步印证了上述结论,但本研究首次发现,青蒿素可以明显降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和beclin-1表达,及抑制过度自噬减轻心肌缺血再灌注损伤。

研究表明,自噬是心肌I/R的重要病理生理机制之一[1,2]。I/R诱导的ATP耗竭、氧化应激、内质网应激和蛋白质降解等均会增强自噬[5]。自噬对细胞的影响是多面性的,适度的自噬可以帮助细胞清除降解的蛋白质和损伤的细胞器,具有保护作用,但过度激活自噬却可以导致细胞程序性死亡。目前自噬对心肌I/R的作用尚无定论,通常认为,在心肌缺血阶段,自噬被适度激活,表现为心肌保护作用,但在再灌注阶段,自噬被过度激活,表现为加重心肌损伤的作用[1,2]。Matsui等[1,2]证实,在心肌再灌注阶段beclin-1水平明显升高bcl-2明显降低,标志自噬被过度激活,进而诱发细胞程序性死亡。Beclin-1是一种关键的自噬蛋白,可以调节自噬小体的形成和进展。在再灌注阶段,beclin-1是诱导自噬过度激活的关键蛋白,研究证实,通过siRNA抑制beclin-1表达可以抑制自噬的过度激活,减轻I/R损伤[7]。众所周知,在再灌注阶段,氧自由基的过度生成而非能量耗竭是诱导细胞自噬的主要因素。Hariharan等[8]证实,氧自由基的生成伴随beclin-1的高表达,给予抗氧化剂处理可明显降低beclin-1的表达,这说明,活性氧是通过调节beclin-1的表达调节再灌注阶段的心肌细胞自噬。另外,LC3为自噬相关蛋白,IL3-Ⅱ为脂质化的活性状态,IL3-Ⅰ为未脂质化的非激活状态,LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值可以反应自噬的激活状态。研究发现,活性氧可通过抑制ATG4的激活,促进LC3脂质化激活自噬[9]。本研究发现,青蒿素可以明显抑制氧化应激(降低MDA水平,升高SOD水平),抑制过度自噬(降低beclin-1水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值),因此我们推测,青蒿素可以通过抑制氧化应激,抑制心肌I/R中自噬过度激活。

综上所述,青蒿素可以通过抑制过度自噬减轻心肌I/R损伤,其可能通过抑制氧化应激,抑制再灌注阶段自噬过度激活。

参考文献:

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Artemisinin Alleviates Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury via Autophagy Regulation

SHEN Xiu-zhen,WANG Ling,FANG Yi-huang

(DepartmentofCardiology,People'HospitalofChibi,ChibiHubei437300,China)

ABSTRACT:Objective To investigate the protective effect of artemisinin on myocardial ischemia and reperfusion(I/R) injury and the possible mechanism. Methods Rat I/R model was established by ligation of left anterior descending coronary artery for30min,followed by reperfusion for 4h.30 rats were divided into three groups: sham-operated group (SO),ischemia and reperfusion group (I/R) and artemisinin treatment group (A+I/R),10 rats in each group.Cardiac injury markers (serum creatine (CK),lactate dehydrogenase (LDH),and cTnI),oxidative stress indexes (malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) and autophagy markers (beclin-1 and LC3) were detected.Results Compared with SO group,the levels of CK,LDH,cTnI MDA and the activity of SOD were significantly increased;autophagy was excessively activated in I/R group.Compared with I/R group,artemisinin significantly decreased the contents of CK,LDH,cTnI and MDA and increased the activity of SOD in myocardial tissue,decreased beclin-1 level and LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio,suppressed excessive activation of autophagy .Conclusion Artemisinin can protect against myocardial I/R injury via suppressing oxidative stress and excessiveof activation autophagy.

KEY WORDS:Artemisinin;Autophagy;Oxidative stress;Myocardial ischemia;Reperfusion injury

中图分类号:R-33

文献标识码:A

文章编号:2095-4646(2016)03-0191-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0191

(收稿日期:2016-01-22)

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