HPLC法测定枸杞子配方颗粒中甜菜碱的含量

李 晶，郑新元，王 杰

(天津市药品检验所，天津 300070)

HPLC法测定枸杞子配方颗粒中甜菜碱的含量

李 晶，郑新元，王 杰*

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的:建立枸杞子配方颗粒中甜菜碱的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法，乙腈－水(85∶15)为流动相，流速为1．0 ml/min，柱温为30℃，检测波长为200 nm，色谱柱为Kromasil NH2(250 mm×4．6 mm，5 μm)。结果:6个厂家13批次的枸杞子配方颗粒中甜菜碱含量介于0．542 8～2．055 6 mg/g之间。结论:该方法操作简便，结果稳定可靠，可用于枸杞子配方颗粒的质量评价。

枸杞子配方颗粒，HPLC，甜菜碱

枸杞子是我国常用中药之一，为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L的干燥成熟果实，味甘，性平，具有滋补肝肾、益精明目的功效［1］，用于治疗虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳痿遗精、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明。枸杞子配方颗粒是将单味枸杞子饮片经现代提取技术及制剂工艺精制而成的，是供中医临床代替饮片用的配方颗粒。甜菜碱是枸杞子中主要成分之一，且含量较高，对其进行含量测定，可以保证临床用药的安全、有效。《中国药典》2015年版枸杞子项下关于甜菜碱的定量方法仍采用薄层扫描法，该方法操作复杂，重复性差，不利于有效控制产品质量。本文建立的HPLC法测定枸杞子配方颗粒中甜菜碱的含量，操作简便、重现性好、专属性强、灵敏度高、结果准确，适合作为该品种的含量测定方法。

1 仪器与试药

LC－10A型高效液相色谱仪;SPD－10A紫外检测器;Anastar色谱工作站。甜菜碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110894－200503)。枸杞子配方颗粒由广东一方制药有限公司(厂家 1，批号1110021、1109254)、江阴天江药业有限公司(厂家2，批号1110127、1108461)、四川新绿色药业股份有限公司(厂家3，批号1109058、1110138)、北京康仁堂药业有限公司(厂家4，批号101001、101101)、华润三九医药股份有限公司(厂家5，批号1106181S、1109011S)、培力(南宁)药业有限公司(厂家6，批号A110362、A110678)提供。1，2－二氯甲烷为色谱纯，乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 检测波长的确定 由于甜菜碱结构中没有明显的共轭双键，属于末端吸收，故选200 nm作为检测波长，提高检测灵敏度。

2.2 色谱条件 色谱柱:迪马公司Kromasil NH2(250 mm×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈－水(85∶15);流速:1．0 ml/min;检测波长:200 nm;柱温:30℃;进样量:20 μl。理论板数按甜菜碱计算应不低于2 000。

2.3 溶液的制备

2．3．1 对照品溶液的制备 取甜菜碱对照品10．64 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。再精密吸取3．0 ml至10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2．3．2 供试品溶液的制备 取重量差异下的枸杞子配方颗粒，研细，取适量(相当于1．0 g饮片)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1，2－二氯甲烷－甲醇的混合液(50∶50)50 ml，超声处理30 min，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱(内径1．5 cm，8 g，干法装柱)，用100 ml混合液洗脱，收集洗出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密量取对照品溶液、供试品溶液各20 μl，按“2．2”项下色谱条件测定，记录色谱图，见图1。

图1 甜菜碱对照品(A)枸杞子配方颗粒(B)的HPLC色谱图

2.4 线性关系试验 取0．425 6 mg/ml甜菜碱对照品储备液，精密吸取0、1．0、2．0、3．0、4．0和5．0 ml分别置10 ml量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀。分别取上述溶液20 μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件分别进样，测定峰面积值。以浓度(μg/ml)为横坐标，相应的峰面积值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1 158．91 X－531．0(r=0．999 9)。结果表明甜菜碱在0～212．80 μg/ml范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取线性关系试验项下浓度为127．68 μg/ml的对照品溶液，按“2．2”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积值，其RSD值为0．97%，结果表明仪器精密度良好。

2．6 稳定性试验 取枸杞子配方颗粒(广东一方制药有限公司，批号1109254)供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8和24 h测定峰面积值，其RSD值为0．5%，结果表明供试品溶液在24 h内测定是稳定的。

2．7 重现性试验 取上述同一批号枸杞子配方颗粒6份，按“2．3．2”项下制备方法制成供试品溶液。按“2．2”项下色谱条件进样，测定样品峰面积值并计算样品中甜菜碱的含量，结果测得枸杞子配方颗粒中甜菜碱的平均质量分数为0．403 0%，RSD为1．09%。

2．8 回收率试验 取上述同一批号枸杞子配方颗粒，精密称取150 mg，平行6份，分别精密加入甜菜碱对照品溶液(浓度为0．122 2 mg/ml)5 ml，补加1，2－二氯甲烷－甲醇的混合液(50∶50)至50 ml，再按上述“2．3．2”项下供试品溶液的制备方法操作，按“2．2”项下色谱条件进样，测定峰面积值，计算回收率，结果平均回收率为99．87%，RSD为1．77%，见表1。

2．9 样品测定 取枸杞子配方颗粒各厂家各批次样品，按上述“2．3．2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液。按上述色谱条件分别进样，测定峰面积值，计算每相当于1 g饮片的枸杞子配方颗粒含甜菜碱的量(mg/g)，结果见表2。

表1 回收率试验结果(n=6)

表2 样品的测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 测定方法的选择 有文献报道［2］，采用HPLC法测定枸杞子中甜菜碱的含量，但供试品采用离子交换树脂进行前处理，操作复杂，误差较大，重现性不好。本实验建立的方法重复性好，易于操作。

3.2 样品前处理方法的选择 参照文献［3］报道方法，试验中分别考查了甲醇提取、甲醇提取后经阳离子交换树脂净化方法，结果显示杂质干扰较大，本实验采用了1，2－二氯乙烷－甲醇的混合液(50∶50)提取，碱性氧化铝净化的方法对样品进行前处理。

3.3 提取时间的选择 在提取供试品过程中，分别超声处理10、20、30和40 min，试验结果表明:超声30 min提取的甜菜碱的量与40 min时相比，其含量基本一致，故提取时间选择30 min。

3.4 洗脱溶媒的选择 选用不同比例的洗脱液:分别为1，2－二氯乙烷 －甲醇(95∶5)、(90∶10)、(85∶15)、(80∶20)、(70∶30)、(60∶40)、 (50∶50)、(40∶60)、(30∶70)、(20∶80)和(10∶90)，试验结果表明:甜菜碱在1，2－二氯乙烷－甲醇(80∶20)时，开始洗脱下来，在1，2－二氯乙烷－甲醇(30∶70)时，开始出现杂质峰，干扰测定，1，2－二氯乙烷－甲醇(70∶30)到(50∶50)时洗脱的最多，故洗脱溶媒选择1，2－二氯乙烷－甲醇(50∶50)。

1 中国药典［S］．一部．2015:249

2 甄录旭，方宗华，吴海林，等．HPLC法测定枸杞子中甜菜碱的含量［J］．安徽医药，2007，11(8):703－704

3 方丽，祝明，郑成．HPLC法测定枸杞子中甜菜碱的含量［J］．中国药品标准，2011，12(4):288－291

Determination of content of betaine in Wolfberry fruit formula granule by HPLC

Li Jing，Zheng Xinyuan，Wang Jie
(Tianjin Insititute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective:To establish an HPLC method for determination of betaine in wolfberry fruit formula granule．Methods: HPLC was performed on a Kromasil NH2(250 mm×4．6 mm，5 μm)column at 30℃ with mobile phase consisting of acetonitrilewater(85∶15)，the flow rate was 1．0 ml/min，the detection wavelength was 200 nm．Results:The content of betaine in wolfberry fruit formula granule in 13 batches from six factories ranged between 0．542 8～2．055 6 mg/g．Conclusion:The method is simple and reliable，and can be used for the quality evaluation of betaine in wolfberry fruit formula granule．

wolfberry fruit formula granule，HPLC，betaine

R927．2

A

1006-5687(2016)03-0004-03

2016-03-03

天津市科技支撑计划重点项目(No．12ZCZDSY01000)

*通讯作者:王杰，E－mail:tjyjsjie@sina．cn。