金针菇发酵液和BTH对烟草抗病性的诱导作用

张清霞++王英+李曦+刘正坪++唐文华+童蕴慧

摘要：利用烟草-花叶病病害体系检测苯并噻唑硫代乙酸甲酯（benzothiadiazoles，BTH）、金针菇（Flammulina velutipes）发酵液提取物（JZG）诱导抗病作用。试验用盆栽珊西烟（Nicotiana tobacum，Xanthi-nc）为材料，用诱导剂处理烟草第6片叶，然后在上部未处理叶接种烟草花叶病毒（TMV），结果发现上部叶片产生的TMV枯斑数与对照相比显著减少，说明这2种诱导剂能诱导烟草植株产生系统抗病性。同时研究了BTH、JZG作为诱导剂处理烟草后寄主内几种抗病相关酶的变化，结果表明烟草叶片组织中的几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶活性增加，且酶活性可在处理后15 d内维持高于对照组的水平。

关键词：几丁质酶；β-1，3-葡聚糖酶；烟草；金针菇；病程相关蛋白

中图分类号： S435.72文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0220-02

收稿日期：2015-05-11

基金项目：国家自然科学基金（编号：31000875）；扬州大学生科技创新基金资助。

作者简介：张清霞（1976—），女，博士，副教授，主要从事植物病害生物防治。E-mail：zqx817@sohu.com。

通信作者：唐文华，博士，教授，主要从事土传病害生物防治研究。E-mail：wenhuatang@sina.com。诱导抗性是指植物受到适当刺激后获得的对随后病原菌侵染的抵抗能力[1]。许多植物上诱导的防卫反应不仅在植物的初侵染部位增强，而且在未受侵染、空间上隔离的部位也增强，这种诱导抗性又称为系统性获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。病原菌诱导的SAR一个显著特征就是寄主植物水杨酸（ssalicylic acid，SA）合成的增加。SA是SAR信号传导中的重要因子。SAR的另一个特征是所谓的SAR基因的激活，包括编码病程相关蛋白的基因[2]，它们通常被用作诱导抗性的标记。人们通过系统研究发现，不但真菌、细菌和病毒能诱导植物产生抗病性[2-3]，而且一些体外无杀菌作用的化学物质，如水杨酸（SA）、2，6-二氯异烟酸（INA）、苯并噻唑硫代乙酸甲酯（benzothiadiazole，BTH）[4]等也具有这种能力。

植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间长、系统性等优点，而且大部分的诱导剂对环境无污染[5]。这些特点说明植物诱导抗病性在农业生产上具有良好的应用前景。BTH就是这样一个理想的诱导剂，它不仅能诱导植物抵抗苗期病害，而且对植物采后病害也有良好的防治效果[6]。但是BTH目前只在欧洲市场实现了商品化，在我国尚未注册应用。本项工作作为寻找新型诱抗剂的初步研究，利用烟草系统来检测金针菇发酵液是否具有诱导寄主抗病性的功能，以及经该液体处理后寄主体内抗病相关蛋白的变化。

1材料与方法

1.1植物材料

烟草品种：珊西烟（Nicotiana tobacum，Xanthi-nc），温室中自然光照生长，植株第13片真叶完全展开时用于试验。

1.2供试抗性诱导剂

JZG（金针菇发酵液提取物），金针菇菌株接入马铃薯液体培养基中，放置振荡摇床（130 r/min）培养12 d（28 ℃），纱布过滤，滤液用乙酸乙酯以1 ∶ 1比例抽提，然后旋转蒸发，以甲醇溶解浓缩物（浓缩1 000倍），使用时兑蒸馏水稀释1 000倍；BTH（benzothiadiazoles），诺华农化有限公司生产，使用浓度为75 μg/mL。

1.3供试毒源与浓度

TMV毒源由中国农业大学植病系病毒室提供，取1 g病叶加10 mL磷酸缓冲液（pH值 6.8）研磨成匀浆，纱布过滤，磨擦接种普通烟，发病后病叶用作TMV毒源。

1.4处理时间与方法

取长势均一的珊西烟（13叶期），各种诱导剂或清水以涂抹方式处理烟草的第6片叶，以湿润为准。清水处理为对照。每个处理3次重复，每个重复3株。处理6 d后，在上部未用诱导剂处理的第7、8、9片叶片表面采用摩擦接种法接种TMV。

1.5调查时间

TMV枯斑充分表现（接种TMV后2～3 d，25 ℃），统计各处理不同叶位的枯斑数目。

1.6取样方法

分别在诱导剂处理珊西烟后1、6、9、15、20、25 d，取上部未处理的第7、8、9叶为样本，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.7酶活性的测定

将各处理珊西烟叶片在液氮中研磨，按1 g ∶ 2 mL的比例用0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液（pH值为5.0）制成匀浆，15 000 r/min 离心15 min（4 ℃），取上清液为粗酶液。按 Boller 的方法[7]测定总几丁质酶活力。总几丁质酶活力的定义：在以上条件下催化相当于1 μmol N-乙酰基葡糖胺（GluNAc）所需的酶量为1个酶活单位（U）。按 Abeles 等的方法[8]测定β-1，3-葡聚糖酶活力。β-1，3-葡聚糖酶活力的定义：1 min产生1 μmol葡萄糖当量还原糖的酶量为1个酶活单位（U）。

2结果与分析

2.1BTH与JZG对珊西烟抗病性的诱导

使用BTH与JZG处理珊西烟第6片叶，6 d后在上部未处理的第7、8、9片叶接种TMV，接种2 d后枯斑反应完全显现。由表1可见，BTH和JZG处理的第7、8、9片叶上的TMV枯斑数较对照差异显著（P<0.05），据目测观察，病斑大小无差异。TMV枯斑数以第7叶上最多，第8叶、第9叶次之，说明BTH、JZG在幼嫩组织上诱导的抗性较强，这也符合系统性诱导抗性的特性。说明BTH和JZG能诱导植株产生系统抗性，减少了TMV的侵染。

2.2BTH和JZG处理珊西烟后总几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的变化

用BTH和JZG 处理珊西烟第6片叶，对照用清水处理，之后1、6、9、15、20 d及25 d取上部未处理叶片为样本测定总几丁质酶的活性和β-1，3-葡聚糖酶活性，结果见图1，BTH和JZG均能增强珊西烟叶片中总几丁质酶活性。从处理后 1 d 即可检测到酶活性高于对照，BTH处理珊西烟后烟草叶组织中几丁质酶活性持续上升，处理后25 d内维持高于对照的酶活性水平，且在处理后20 d达到最高，以后逐渐下降直至对照水平；JZG处理的珊西烟几丁质酶活性则在诱导后 15 d 达到最高水平。对β-1，3-葡聚糖酶的检测发现了相似的结果（图2）：BTH和JZG处理珊西烟后，均使其叶片组织中β-1，3-葡聚糖酶活性增加，明显高于对照水平，二者都能在诱导后15 d内使β-1，3-葡聚糖酶活性保持高于对照的水平，以后酶活性缓慢下降。BTH和JZG处理珊西烟后，珊西烟叶片的总几丁质酶活性由低到高增加，以后呈下降趋势，而β-1，3-葡聚糖酶活性虽然高于对照，但是从诱导1 d起就呈下降趋势。

已有报道说明BTH能在许多作物上诱导SAR，在烟草上可诱导几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性增强[9]。JZG与BTH在珊西烟上具有相似的反应，都可诱导几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，并且降低TMV的侵染率，说明JZG作为诱导剂可诱导植物产生防卫反应。

3讨论

用BTH和JZG处理珊西烟下部叶片后，发现上部未处理叶片上TMV枯斑数目均较清水对照显著减少。这一特性符合系统性获得性抗性的主要特征：即经过生物的或非生物因子诱导处理后，植株处理或未处理部位产生对随后病原物侵染的抗性。

几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶是植物病程相关蛋白（PRs），也是SAR的重要标记。正常情况下，这2种酶只有低水平的组成型表达，当用诱导因子处理后，酶活性会迅速增加。这2种酶在离体条件下具有联合抑菌活性，因此通常被看作是植物抵抗病原菌潜在的抗性机制[10-11]。BTH和JZG能诱导珊西烟体内总几丁质酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性的提高，并且能维持较长一段时间，这对于诱导抗病效果是一个重要的影响因素。BTH和JZG诱导珊西烟后20 d内，几丁质酶活性保持在较高的水平，β-1，3-葡聚糖酶活性也可在诱导后15 d内维持在较高的水平。这说明BTH和JZG处理珊西烟植株15～20 d内，植株是处在抗病反应时期。这为适时地使用BTH和JZG提供了参考的信息，即可在病害发生前的15 d内使用诱导剂。

BTH是已经商品化的诱抗剂，它能在许多作物上诱导抗性，而且其诱导植物的抗性与其诱导的几丁质酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性的增加有关[12]。本研究表明金针菇发酵液提取物与BTH有相似的抗TMV反应，且具有相似的酶活性变化趋势。这说明JZG作为诱导剂可能诱导植物产生与BTH诱导（部分）相同的防卫反应，也就是说金针菇发酵液的乙酸乙酯提取相中有起诱导作用的物质，其有效成分还有待于今后进一步研究确认。

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