结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片对活动性与非活动性结核患者疗效的评价

宋能，刘焰，段元山，马杰Δ

(1.湖北省中西医结合医院 检验科，湖北 武汉 430015；2.武汉大学基础医学院 免疫学系，湖北 武汉 430071)

结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片对活动性与非活动性结核患者疗效的评价

宋能1，刘焰2，段元山1，马杰1Δ

(1.湖北省中西医结合医院 检验科，湖北 武汉 430015；2.武汉大学基础医学院 免疫学系，湖北 武汉 430071)

目的 探讨结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片用于活动性结核患者与非活动性结核患者的诊断价值。方法 采用结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片分别对湖北省中西医结合医院检验科178例活动性结核病患者和79例非活动性结核病患者以及92例健康对照血清样本进行检测。结果 结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片对结核病总阳性率为58.4%；3项蛋白的联合诊的辅助诊断价值高于单项蛋白的辅助诊断价值；16kD蛋白对非活动性结核阳性率为16.4%，优于其对活动性结核3.4%的阳性率(P<0.05)。结论 结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片对活动性结核和非活动性结核均具有一定的辅助诊断价值，在非活动性结核患者中16kD蛋白阳性率略高于38kD蛋白(P<0.05)。

结核分枝杆菌；蛋白芯片；非活动性结核患者；结核诊断

结核病目前仍是发展中国家亟待解决的公共健康问题。据世界卫生组织(WHO)调查报告显示2012年全球约有130万人死于结核病[1]。2014年我国结核病发病率的世界排名虽较2013年下降，但仍高居世界第三位，所以早期明确的诊断对结核病的治疗及预后有着极其重要的意义[2]。目前临床上应用的结核病实验室诊断技术主要有结核菌素(PPD)试验、痰细菌培养、抗酸染色、PCR、IFN-γ的T-Spot检测及基因芯片等方法。近年来，国内外相继报道使用阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)脂多糖、纯化蛋白抗原A95，结核菌重组蛋白抗原38kD[3]、16kD[4]和14kD等在结核病抗体检测中的作用。我国研发出的基因工程表达结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)重组蛋白抗原16kD、38kD、LAM蛋白，利用蛋白芯片技术制成结核分枝杆菌相应抗体检测试剂盒[5]。本次研究采用国内南京大渊公司的蛋白芯片试剂盒进行临床检测试验，以评价其用于本院活动性结核患者与非活动性结核患者的辅助诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年4月～2016年10月间在湖北省中西医结合医院临床各科室送检至检验科的成年结核病患者257例，其中肺结核129例，淋巴结核64例，骨结核23例，结核性腹膜炎17例，结核性心包炎9例，结核性脑膜炎7例，结核性胸膜炎6例，肾结核2例。其中活动性结核患者178例，其中男性108例，女性70例，年龄范围19～93岁，平均年龄(42.4±12.5)岁，病程2～36个月，平均病程(6.5±4.9)个月。本文将既往结核患者经联合用药后无症状复查者，定义为本研究的非活动性结核病患者共79例，其中男性46例，女性33例，年龄范围为20～82岁，平均年龄(44.56±11.8)岁，病程为5～60个月，平均病程(10±6.2)个月。选取2016年7月～2016年10月间在湖北省中西医结合医院体检中心体检的健康成年人92例，其中男性56例，女性36例，年龄范围23～65岁，平均年龄(43.11±8.4)岁，作为本研究的健康对照。本研究经患者知情同意，并得到医院伦理委员会批准。

结核患者参照Thuaites诊断标准及Thuaites诊断指数[6-7]为依据并将其纳入：①肺结核的诊断：a.胸部X线肺叶阴影；b.增强CT扫描结果与X线基本吻合；c.抗酸染色阳性；d.抗结核治疗症状有显著改善。②其它部位结核的诊断：a.患病组织病原学检查阳性；b.血清T-Spot检测阳性；c.抗结核治疗症状有显著改善。各组患者在年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器：结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(南京大渊生物技术工程有限责任公司生产，国食药监械(准)字2011第3400173号)。大渊PBT-X4型生物芯片识别仪系统Potomac PBT-X4 Bio-chip Scanner System(南京大渊生物技术工程有限责任公司生产)。

1.2.2 样本的采集：使用黄头促凝血负压管抽取患者静脉血4～5 mL(溶血样本和高脂血样本不宜)，取血后颠倒试管2～3次以便促凝剂与血液充分混匀，静置3～5 min后使用离心机离心，离心条件为：转数3 500 r/min离心血液6 min。离心后，取上层不少于150 μL血清用于检测。

1.2.3 检验方法：从冰箱中取出芯片与配套试剂，室温放置10 min平衡至室温，从铝箔袋中取出芯片，在芯片上标注待检者姓名或编号。在平衡至室温的前提下，在蛋白芯片窗口中用加样枪加入200 μL试剂A(主要活性成分：2%吐温、Tris缓冲液)；待窗口中的试剂A浸润完后，室温静置1 min后用加样枪加入样本血清100 μL；待样本血清完全渗入后，及时用加样枪加入300 μL试剂B(主要活性成分：2%吐温、Tris缓冲液)；待试剂B完全渗入后，用加样枪加入500 μL试剂C(主要活性成分：金标抗人IgG)；待试剂C完全渗入后，最后用加样枪加入300 μL试剂D(主要活性成分：2%吐温、Tris缓冲液)；4种试剂以及样本加入完成后，于30 min内将芯片置于大渊PBT-X4型生物芯片识别仪系统相应位置，安生物芯片识别仪检测操作步骤进行结果分析，系统将自动判读出检测结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，2组患者的阳性率比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组结核分枝杆菌抗原阳性率的比较 采用χ2检验得出，对照组与活动性结核组的阳性率的差异有显著的统计学意义(P<0.01)。对照组与非活动性结核阳性率也具有显著的统计学意义(P<0.05)。活动性结核的阳性率为71.3%明显高于非活动性结核的阳性率29.1%(P<0.05)，结核分枝杆菌IgG抗体蛋白芯片对结核病总阳性率为58.4%。

表1 结核分枝杆菌抗原阳性率的比较Tab.1 Comparison of M. tuberculosis antigen positive rate

2.2 两类结核病与3种抗原蛋白检测阳性率的比较 结果如表2中所示：LAM蛋白在活动性结核(阳性率67.4%)与非活动性结核(阳性率24%)检测结果中其阳性率均为最高，差异具有统计学意义(P<0.05)，活动性结核患者16kD蛋白16.4%的阳性率明显高于非活动性结核患者16 kD蛋白3.4%的阳性率，差异有显著的统计学意义(P<0.05)。

表2 不同结核抗体蛋白检测阳性率的比较[n(%)]Tab.2 Comparison positive rate of different M.tuberculosis antibody proteins[n(%)]

3 讨论

结核病是由M.tuberculosis引起的一种慢性传染病，该病严重威胁人类健康。早期结核患者往往仅有低热、乏力、消瘦等一般性症状，特别是目前发病率越来越高的肺外结核，如症状并不明显的肝结核、胰结核、肾结核、腹膜结核、骨结核等，使传统的结核病诊断手段例如X-线检查[8]、积液痰液微生物学检查[9]等阳性率并不尽如人意。虽然近年来有很多新技术例如ddPCR对结核病的诊断灵敏度有很大的提升[10]，但是迫于成本压力使得其普及仍有待时日。单项辅助诊断的各种缺点，使大量结核病患者未能被及时诊断而延误了治疗时机，导致体内大量结核结节形成，这些结核结节的存在一直被怀疑是导致非活动性结核患者后期结核复发的根源[11]。

LAM是M.tuberculosis细胞壁脂多糖的主要成分，分子量为17.5kDa[12]。它的结构复杂，包含三个不同的结构域。在人体内慢性生长的结核分枝杆菌菌体表面的糖脂结构中，部分LAM链的非还原性末端有相应的帽结构存在，这种结构能改变人体免疫系统对M.tuberculosis的免疫调节方式。国内有实验证明，M.tuberculosis菌体表面的LAM结构能帮助它抑制巨噬细胞对其的杀伤，导致巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌之后，使其在巨噬细胞内潜伏并生存[13]。作为检测M.tuberculosis的特异分子，由于LAM在其它类型的分枝杆菌表面含量很低，无法像M.tuberculosis一样刺激人体免疫系统产生大量的特异性抗体，故其特异度要明显优于其它抗原分子。38 kD蛋白是M.tuberculosis蛋白抗原之一，以一种类脂蛋白，它对M.tuberculosis的生长具有重要的生化和调节作用[14]。Haslov等比较了包括38 kD蛋白在内(不包括LAM)的五种结核分枝杆菌抗原，他发现38 kD蛋白所产生的免疫效应最强，而且缺乏38 kD蛋白抗体的血清很难与结核分枝杆菌的其他抗原产生反应[15-16]。关于16 kD蛋白的报道，并不如以上两种蛋白多，对于该蛋白多见于休眠期结核分枝杆菌中，而在其它非结核分枝杆菌中不存在该蛋白的表达，故其它分枝杆菌对机体的感染并不能诱导产生抗16 kD蛋白抗体[5]。

结核蛋白芯片技术是以微孔滤膜为载体, 同时将结核菌的细胞壁脂多糖LAM抗原和结核菌16 kD和38 kD抗原固定在微孔滤膜上, 利用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，借助抗原抗体反应与患者血清中的特异性抗体结合，再与人源性抗体混合，利用胶体金法，在微孔滤膜上形成紫红色斑点。反应完成后30 min内，使用厂家提供的芯片识别仪扫描并使用芯片识别系统进行结果分析，同时检测出患者血清中所含的细胞壁脂多糖LAM的抗体、38 kD抗体和16 kD抗体。这3种抗体的同步检测，对结核分枝菌感染具有辅助诊断价值[17]。除了对肺结核的诊断，国内一些学者通过分析病例也证明了结核蛋白芯片对肺外结核患者诊断的优越性[5]。

本研究结果显示结核蛋白芯片检测总的阳性率为45.0%。在患病部位的结核病人中阳性率差别较大,但无论是在活动性还是非活动性结核患者中LAM蛋白都比16 kD蛋白和38 kD蛋白的阳性率要高(P<0.05)。LAM作为M.tuberculosis细胞壁的表面抗原，其特异性强，有较强的免疫源性，在感染的宿主内，常会引起强烈的抗体反应，能有效刺激机体产生IgG型的抗LAM抗体。故无论是活动性还是非活动性结核患者，其阳性率都为最高(P<0.05)。活动性结核患者的检测结果显示，3种抗体以LAM蛋白最为灵敏,38 kD蛋白次之,16 kD蛋白最差；对非活动性结核患者的检测显示，3种抗体仍以LAM蛋白最为灵敏，但是16 kD蛋白次之，38 kD蛋白最差。16 kD蛋白对非活动性结核患者的阳性率明显高于结核患者(P<0.05)，其原因有待进一步探索。

M.tuberculosisIgG抗体蛋白芯片检测速度快，采取血液样本离心之后，只需要10 min左右就能判定出相应抗体的阴阳性，方便单人操作，提高了工作效率与检验效率，公司提供配套的芯片灰度扫描仪，基本消除了肉眼判读的误差，质控数据量化，相比其他的结核检测具有一定的优势，其特异性也基本令人满意。并且该芯片采用了3种抗体联合检测，相比单抗体检测提高了检测的阳性率，而且该技术不受外国专利垄断，价格亲民，是一种值得推广的结核检测技术。

[1] Glaziou P,Floyd K,Raviglione M.Global burden and epidemiology of tuberculosis[J].Clin Chest Med.2009,30(4):621-636.

[2] Glaziou P,Sismanidis C,Floyd K,et al.Global epidemiology of tuberculosis[J].Cold Spring Harb Perspect Med.2015,5(2):a17798.

[3] Bothamley G H.Serological diagnosis of tuberculosis[J].Eur Respir J Suppl.1995,20:676-688.

[4] Hu Y M,Butcher P D,Sole K,et al.Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock[J].FEMS Microbiol Lett.1998,158(1):139-145.

[5] 杨群，江晓静.结核蛋白芯片对肺结核及肺外结核的诊断价值[J].西安交通大学学报(医学版).2012(1)：129-131.

[6] Thwaites G E,Chau T T,Stepniewska K,et al.Diagnosis of adult tuberculous meningitis by use of clinical and laboratory features[J].Lancet.2002,360(9342):1287-1292.

[7] Thwaites G E,Nguyen D B,Nguyen H D,et al.Dexamethasone for the treatment of tuberculous meningitis in adolescents and adults[J].N Engl J Med.2004,351(17):1741-1751.

[8] 董莘，秦崇，敖国昆.活动性和非活动性结核的薄层CT特征[J].中华临床医师杂志(电子版).2011(20)：5919-5924.

[9] 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志.2002(2)：3-46.

[10] 宋能，谭杨，罗凤玲，等.微滴数字PCR定量检测全血样品中结核分枝杆菌特异CFP10基因[J].中国生化药物杂志.2016(2)：10-15.

[11] 桂钱欢，李波，余雨，等.胸腰椎结核前路术后复发的原因及再手术治疗[J].临床骨科杂志.2016(2)：133-136.

[12] Pienaar M,Andronikou S,van Toorn R.MRI to demonstrate diagnostic features and complications of TBM not seen with CT[J].Childs Nerv Syst.2009,25(8):941-947.

[13] 王一鸣，陶晶，郭晓奎，等.蛋白质组学在结核分枝杆菌研究中的应用[J].微生物学通报.2009(2)：245-249.

[14] Young DB,Garbe TR.Lipoprotein antigens of Mycobacterium tuberculosis[J].Res Microbiol.1991,142(1):55-65.

[15] Wilkins EG,Ivanyi J.Potential value of serology for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis[J].Lancet.1990,336(8716):641-644.

[16] Haslov K,Andersen A B,Ljungqvist L,et al.Comparison of the immunological activity of five defined antigens from Mycobacterium tuberculosis in seven inbred guinea pig strains.The 38-kDa antigen is immunodominant[J].Scand J Immunol.1990,31(4):503-514.

[17] 段慧萍，郭东菊.结核蛋白芯片检测对结核病诊断的价值[J].山西医科大学学报.2010(8):716-718.

(编校：师维康)

Evaluation ofmycobacteriumtuberculosisIgG antibody protein chip in patients with active and inactive tuberculosis

SONG Neng1, LIU Yan2, DUAN Yuan-shan, MA Jie1Δ

(1. Clinical Laboratory, Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Wuhan 430015, China; 2. Department of Immunology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences, Wuhan 430015, China)

ObjectiveTo explore protein microarray chip diagnostic value for patients with active and inactivetuberculosis.Methods178 cases of active patients tuberculosis and 79 cases of inactive tuberculosis patients and 92 cases of healthy control using protein microarray chip detection.ResultsTuberculosisprotein chip had a diagnostic value fortuberculosisand the positive rate is 58.4%; combined the diagnostic value of three kinds of proteins is higher than the diagnostic value of a single protein；16 kD protein of inactivetuberculosispositive rate was 16.4%, better than the positive rate of 3.4% for active tuberculosis (P<0.05).ConclusionTuberculosis protein chip has a diagnostic value for activetuberculosisand inactive tuberculosis. 16 kD protein positive rate more than 38 kD protein in patients with inactivetuberculosis(P<0.05).

M.tuberculosis; protein microarray chip; inactivetuberculosis; diagnosis oftuberculosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.050

宋能，男，硕士，检验科医师，研究方向：临床免疫学与分子生物学诊断，E-mail：Soner2008@qq.com；马杰，通信作者，女，硕士生导师，检验科主任，研究方向：临床免疫学与分子生物学检验，E-mail：majie588@126.com。

R378.91+1；R825.2

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