白花蛇舌草对Renca肾癌细胞模型小鼠凋亡相关蛋白Fas、caspase3及caspase7表达影响

周进，赵朋

(天津市南开医院 泌尿外科，天津 300100)

白花蛇舌草对Renca肾癌细胞模型小鼠凋亡相关蛋白Fas、caspase3及caspase7表达影响

周进Δ，赵朋

(天津市南开医院 泌尿外科，天津 300100)

目的 探讨中药白花蛇舌草对Renca肾癌细胞模型小鼠凋亡相关蛋白Fas、caspase3及caspase7表达的影响。方法 选取BALB/C小鼠120只，随机分为正常对照组、模型对照组、白细胞介素组、白花蛇舌草组，各30只，雌雄各半。除正常对照组外，各组均建立肾癌模型，并给予相应的药物治疗。观察所有小鼠的肿瘤体积及重量、抑瘤率，对Fas、FasL、caspase3及caspase7蛋白表达水平进行检测。结果 与模型对照组比较，白花蛇舌草组、白细胞介素组小鼠的肿瘤体积、瘤体重量较低，抑瘤率较高，Fas阳性表达率及Fas蛋白表达较高，FasL阳性表达率及FasL蛋白表达较低，caspase3、caspase7阳性表达率及蛋白表达水平较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。其中白花蛇舌草组以上指标均优于白细胞介素组(P<0.05)。结论 白花蛇舌草能够明显促进肾癌模型小鼠凋亡相关蛋白Fas、caspase3及caspase7表达，抑制FasL蛋白表达，提高抑瘤率。

白花蛇舌草；肾癌；小鼠；细胞凋亡相关蛋白；Fas；caspase

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)简称肾癌，是肾实质泌尿小管上皮系统来源的恶性肿瘤，发病率在泌尿生殖系统中居于第2位[1]，占全身恶性肿瘤的2～3%，每年约有10万余例患者死于该病[2]。近年来，肾癌发病率呈逐渐上升趋势[3]，全世界增长速度约为每年2%。根治性手术是治疗早期肾癌的有效手段，肾癌以腰痛和血尿为常见症状，但发病早期不明显，约有50～60%以上的患者并无明显症状，一旦发现已失去手术时机，而且即使手术，术后有20～40%的可能会复发转移。肾癌对于放疗、化疗均不敏感，免疫治疗及靶向治疗虽可以一定程度上延长生存期[4]，无法在临床上广泛使用。中药在肿瘤治疗中的应用日益受到关注。白花蛇舌草为茜草科草本植物，是常用抗肿瘤中药之一，具有清热解毒、消痛散结的作用，有研究显示，白花蛇舌草能诱导多种肿瘤细胞凋亡[5]，关于其治疗肾癌的相关研究较少。本研究即探讨中药白花蛇舌草对肾癌模型小鼠凋亡相关蛋白Fas、caspase3及caspase7表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选取SPF级8周龄健康成年BALB/C小鼠(由武汉大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2013-0004)120只，体质量(26.47±3.82)g。将鼠箱内温度设置为(18～22) ℃，湿度设置为50～60%，饲以标准饲料(包含20～50%蛋白质，5～10%粗脂肪，3～5%粗纤维)及充足的饮水，自由活动与进食，空气流通，保持安静、温暖、昼夜节律适合的饲养环境，适应性饲养1周。实验过程遵循《实验动物保护条例》相关规定。

1.1.2 药品与试剂：白花蛇舌草，购自天津市南开医院药房(经天津市南开医院中药鉴定教研室鉴定)，加水、煮沸、浓缩至1 g生药/mL；BALB/C小鼠来源的肾癌细胞(Renca)，购自广州吉妮欧生物科技有限公司；重组人白细胞介素-2(125ALa)注射剂，规格：每支20万IU，批号：S20150120，北京双鹤药业股份有限公司；RPMI1640培养基，购自上海博升生物科技有限公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)，上海碧云天生物技术有限公司产品；Fas、FasL、caspase3、caspase7兔多克隆抗体，购自上海瑞齐生物技术有限公司；羊抗兔IgG-辣根过氧化酶(HRP)标记二抗，南京生兴生物技术有限公司产品；二氨基联苯胺(DAB)显色液、苏木素伊红染色液，购自上海鼎杰生物科技有限公司。

1.1.3 仪器：HSP-300-智能恒温恒湿培养箱，江苏省金坛市友联仪器研究所产品；DST673实验动物称量用电子秤，苏州市苏杭科技器材有限公司产品；500-774数显卡尺，日本三丰Mitutoyo公司产品；GE-100凝胶电泳仪，上海谱振生物科技有限公司产品；Tanon-1600凝胶图像处理系统，购自IDE上海天能科技有限公司产品；Eppendorf 5427 R台式高速冷冻离心机，Eppendorf艾本德中国有限公司产品；CX23光学显微镜，日本奥林巴斯株式会社产品。

1.2 方法

1.2.1 白花蛇舌草水煎液的制备：称取白花蛇舌草200 g，研磨成粗粉，加入2 000 mL水浸泡30 min，大火煮沸，文火保持微沸2 h，过滤除菌后，于剩下药渣中加入2 000 mL水，继续煎煮，方法与第一次相同，经纱布过滤除菌后合并2次滤液，浓缩成1 g生药/mL的药液，加适量蒸馏水配制浓度为的6 mg/mL白花蛇舌草溶液。

1.2.2 造模及实验方法[6]：经适应性饲养后，将120只小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、白细胞介素组、白花蛇舌草组共4组，每组各30只，雌雄各半。制备Renca细胞悬液：取出Renca细胞，置于RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清+100 U/mL链霉素+100 U/mL青霉素)中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，待细胞贴壁生长良好，取对数生长期的细胞进行扩增，达到所需细胞数后，收获细胞，清洗后加入适量PBS，配制Renca细胞悬液，浓度为1×107个/mL；接种小鼠：对模型对照组、白细胞介素组、白花蛇舌草组小鼠左腋下皮肤进行消毒，取0.25 mL Renca细胞悬液，进行皮下接种，之后继续正常饲养小鼠，密切观察肿瘤生长情况，2周后，于左腋下触及直径约为5 mm的肿瘤结节，即为造模成功，本实验中各组均成功建立小鼠肾癌模型。模型成功建立后，正常对照组及模型对照组给予0.9%NaCl溶液0.2 mL，1次/天，灌胃；白细胞介素组给予重组人白细胞介素-2(125ALa)注射剂0.2 mL，1次/天，腹腔注射；白花蛇舌草组给予6 mg/mL白花蛇舌草溶液0.2 mL，1次/天，灌胃；各组小鼠均连续给药15d。

1.2.3 观察指标：用药结束后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，对小鼠进行称重，完整剥取肿瘤，测量肿瘤体积及重量，并根据抑瘤率=(模型对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重×100%，计算抑瘤率。

1.2.4 免疫组织化学法检测各组Fas、FasL、caspase3及caspase7的表达水平：将部分肿瘤组织(正常对照组取正常组织)常规固定、石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片，室温下干燥备用。取组织切片脱蜡、水化，采用3%H2O2溶液孵育10 min阻断内源性过氧化物，将切片置于pH=6.0的枸橼酸钠缓冲溶液中加热进行抗原热修复，自然冷却后，分别滴加50 μL Fas、FasL、caspase3及caspase7兔多克隆抗体，置于4 ℃冰箱过夜，37 ℃复温45 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG-HRP标记二抗 50 μL，室温孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次，滴加DAB显色液进行显色，10 min后PBS冲洗，滴加苏木素伊红染色液进行复染，自来水冲洗10 min，常规脱水、透明、中性树胶封片。对切片进行镜检(×200，×400)，光镜下细胞胞质呈棕色或黄色颗粒为阳性，随机选取5个视野，观察计算阳性细胞表达率。

1.2.5 Western blot法检测各组Fas、FasL、caspase3及caspase7蛋白的表达水平：取50 mg肿瘤组织(正常对照组取正常组织)，剪碎至匀浆状，加入1.5 mL胰酶消化细胞，37 ℃恒温振荡20 min后，5 000 r/min离心3 min，PBS冲洗2次；加入1 mL裂解液，冷却30 min，之后1 0000 r/min离心2 min，取上清液；取10 μL上清液，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，之后转膜，将PVDF膜晾干，置于封闭液中震荡封闭1 h，冲洗；滴加Fas、FasL、caspase3及caspase7兔多克隆抗体，孵育2 h后PBS冲洗，滴加羊抗兔IgG-HRP标记二抗，孵育60 min，进行显影定影。采用凝胶图像处理系统，观测Fas、FasL、caspase3及caspase7蛋白的光密度值。

2 结果

2.1 各组小鼠肿瘤体积、瘤体重量以及抑瘤率比较 用药后，与模型对照组比较，白细胞介素组、白花蛇舌草组小鼠肿瘤体积、瘤体重量较低(P<0.05)，与白细胞介素组比较，白花蛇舌草组小鼠肿瘤体积、瘤体重量明显较低，抑瘤率明显较高(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肿瘤体积、瘤体重量以及抑瘤率比较Tab.1 Comparison of tumor size, weight and tumor inhibition rate

#P<0.05，与模型对照组比较，compared with model control group；△P<0.05，与白细胞介素组比较，compared with interleukin group

2.2 免疫组化法检测各组小鼠Fas、FasL阳性表达率比较 用药后，与正常对照组比较，各组小鼠Fas阳性表达率较低，FasL阳性表达率较高(P<0.05)；与模型对照组比较，白细胞介素组、白花蛇舌草组小鼠Fas阳性表达率较高，FasL阳性表达率较低(P<0.05)；与白细胞介素组比较，白花蛇舌草组小鼠Fas阳性表达率较高，FasL阳性表达率较低(P<0.05)。见表2及图1。

表2 免疫组化法检测各组小鼠Fas、FasL阳性表达率比较Tab.2 Comparison of positive expressions of Fas and FasL among each group by immunohistochemistry (±s)

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型对照组比较，compared with model control group；△P<0.05，与白细胞介素组比较，compared with interleukin group

图1 各组Fas及FasL表达情况(×200)A：正常对照组；B：模型对照组；C：白细胞介素组；D：白花蛇舌草组Fig.1 The expressions of Fas and FasL in each group(×200)A：normal control group；B：model control group；C： interleukin group；D：hedyotisdiffusa group

2.3 免疫组化法检测各组小鼠caspase3、caspase7阳性表达率比较 用药后，正常对照组比较，各组小鼠caspase3、caspase7阳性表达率较低(P<0.05)；与模型对照组比较，白细胞介素组、白花蛇舌草组小鼠caspase3、caspase7阳性表达率较高(P<0.05)；与白细胞介素组比较，小鼠白花蛇舌草组caspase3、caspase7阳性表达率明显较高(P<0.05)。见表3及图2。

表3 免疫组化法检测各组小鼠caspase3、caspase7阳性表达率比较

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型对照组比较，compared with model control group；△P<0.05，与白细胞介素组比较，compared with interleukin group

图2 各组caspase3、caspase7表达情况(×400)A：正常对照组；B：模型对照组；C：白细胞介素组；D：白花蛇舌草组Fig.2 Expressions of caspase3 and caspase7 in each group(×400)A：normal control group；B：model control group；C： interleukin group；D：hedyotisdiffusa group

2.4 Western blot法检测各组小鼠Fas、FasL蛋白表达水平比较 用药后，与正常对照组比较，各组小鼠Fas蛋白表达水平较低，FasL蛋白表达水平较高(P<0.05)，与模型对照组比较，白细胞介素组、白花蛇舌草组小鼠Fas蛋白表达水平较高， FasL蛋白表达水平较低(P<0.05)；与白细胞介素组比较，白花蛇舌草组小鼠Fas蛋白表达水平较高，FasL蛋白表达水平较低(P<0.05)。见表4、图3。

表4 Western blot法检测各组小鼠Fas、FasL蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison of expressions of Fas and FasL among each group by Western blot (±s)

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型对照组比较，compared with model control group；△P<0.05，与白细胞介素组比较，compared with interleukin group

图3 各组Fas、FasL蛋白表达A：模型对照组；B：白细胞介素组；C：白花蛇舌草组；D：正常对照组Fig.3 The expressions of Fas and FasL in each groupA：model control group；B：interleukin group；C：hedyotisdiffusa group；D：normal control group

2.5 Western blot法检测各组小鼠caspase3、caspase7蛋白表达水平比较 用药后，与正常对照组比较，各组小鼠caspase3、caspase7蛋白表达水平较低(P<0.05)；与模型对照组比较，白细胞介素组、白花蛇舌草组小鼠caspase3、caspase7蛋白表达水平较高(P<0.05)；与白细胞介素组比较，白花蛇舌草组小鼠caspase3、caspase7蛋白表达水平较高(P<0.05)。见表5、图4。

表5 Western blot法检测各组小鼠caspase3、caspase7蛋白表达水平比较Tab.5 Comparison of expressions of caspase3 and caspase7 among each group by Western blot (±s)

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型对照组比较，compared with model control group；△P<0.05，与白细胞介素组比较，compared with interleukin group

图4 各组Caspase3、Caspase7蛋白表达A：模型对照组；B：白细胞介素组；C：白花蛇舌草组；D：正常对照组Fig.4 The expressions of caspase 3 and caspase 7 in each groupA：model control group；B：interleukin group；C：hedyotisdiffusa group；D：normal control group

3 讨论

中药白花蛇舌草味苦、淡，性寒，归心、肝、脾经，具有清热解毒、消痛散结、利尿除湿的作用，主要用于肺热喘咳、咽喉肿痛、肠痈、疖肿疮疡、癌肿等热毒疾病的治疗，尤善于治疗多种癌肿[7]。药理研究显示，白花蛇舌草含有萜类、游离二萜醇、香豆素、挥发油类、黄酮类、蒽醌类、多糖类、苯丙素类以及含酸化合物等多种化学成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、免疫调节、保肝、神经保护等作用[8]。赵诗云等[9]采用复方白花蛇舌草治疗肺癌荷瘤C57小鼠，发现复方白花蛇舌草能够抑制荷瘤鼠肿瘤的生长，且联合环磷酰胺有减毒增效的作用；彭军等[10]采用白花蛇舌草对结肠癌HT-29细胞进行体外干预，结果发现白花蛇舌草能够影响HT-29细胞周期相关基因表达，阻滞正常周期进程，从而减少癌细胞增殖。目前关于白花蛇舌草治疗肾癌的相关实验研究较少，故本次研究通过皮下接种Renca细胞建立小鼠肾癌模型，观察模型小鼠经白花蛇舌草治疗后肿瘤生长情况以及肿瘤组织Fas、caspase3及caspase7的表达，探讨白花蛇舌草对肾癌的作用。研究结果发现，白花蛇舌草能够有效抑制肾癌组织的增殖，提高抑瘤率。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，而细胞凋亡障碍与恶性肿瘤的发生密切相关[11]。细胞凋亡的过程为接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(caspase)→进入连续反应→细胞凋亡，Fas、FasL、caspase3及caspase7均为细胞凋亡过程中重要蛋白质。Fas属于肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，而FasL是Fas的配体，Fas与FasL结合后可以启动致死性信号转导，开启凋亡过程，若Fas/FasL信号转导系统异常，则会影响细胞正常凋亡。有研究显示，肾癌组织中Fas表达下调，FasL表达升高，Fas/FasL表达异常是肾癌发生发展的原因之一[12]。本研究免疫组织化学法、Western blot法检测结果显示，与模型对照组比较各组小鼠Fas阳性表达率及蛋白表达水平较高(P<0.05)，表明白花蛇舌草对于Fas/FasL信号转导系统具有调节作用，且作用具有剂量依赖性。

Caspase为半胱氨酸蛋白酶，其被激活亦是细胞凋亡过程中的重要环节[13]，激活的caspase能直接破坏细胞结构，下调与DNA修复相关酶、mRNA剪切蛋白等，抑制细胞增殖并促进凋亡。caspase3和caspase7是caspase家族成员，具有相近的底物和抑制剂特异性，能够降解聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)，引发级联反应，直接参与细胞凋亡的执行。有报道称，caspase3、caspase7的低表达与肾癌的预后不良有关[14]。本研究结果表明白花蛇舌草能够上调肾癌组织caspase3、caspase7蛋白表达，促进肿瘤细胞凋亡。

本实验发现白花蛇舌草能够明显促进肾癌模型小鼠凋亡相关蛋白Fas、caspase3及caspase7表达，抑制FasL蛋白表达，提高抑瘤率。白花蛇舌草的成分复杂，具体何种成分对肾癌治疗有效在本研究中并未明确，需进一步研究证实。

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(编校：王俨俨)

Effect of hedyotisdiffusa on expressions of apoptosis related protein Fas，caspase3 and caspase7 in Renca renal cell carcinoma of model mice

ZHOU JinΔ, ZHAO Peng

(Department of Urological Surgery,Tianjin Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)

ObjectiveTo analyse the effect of hedyotisdiffusa on expressions of apoptosis related protein Fas, caspase3 and caspase7 in Renca renal cell carcinoma of model mice.MethodsOne hundred and twenty BALB/C male mice were randomly divided into normal control group, model control group, interleukin group, hedyotisdiffusa group, 30 mice in each group, half male and female.Excepted for normal control group, renal cell carcinoma models were established in the other groups, and were given corresponding drug treatment.The tumor size and weight, and the tumor inhibition rate of all mice were observed, and the expression levels of Fas,FasL,caspase3 and caspase7 were detected.ResultsCompared with model control group, the tumor size and weight were lower, the tumor inhibition rate were higher, the positive expression rates and protein levels of Fas were higher, the positive expression rates and protein levels of FasL were lower, the positive expression rates and expression levels of Caspase3,Caspase7 protein were higher in the mice of interleukin group and hedyotisdiffusa group, all with significant differences (P<0.05).The above indicators in hedyotisdiffusa group were significant improved compared with interleukin group (P<0.05).ConclusionThe hedyotisdiffusa can effectively promote the expressions of apoptosis related protein Fas,caspase3 and caspase7 in renal cell carcinoma of model mice, inhibit the expression of FasL protein, improve the tumor suppression rate.

hedyotisdiffusa; renal cell carcinoma; mice; apoptosis related protein; Fas; caspase

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.009

周进，通信作者，男，硕士，主治医师，研究方向：泌尿系统，E-mail：zhou6323asd@163.com。

R737.11；R285.5

A