盐酸小檗碱对糖尿病大鼠肠道菌群结构的影响

戎鑫仁，贺娅莎，王　彦



盐酸小檗碱对糖尿病大鼠肠道菌群结构的影响

戎鑫仁1，贺娅莎1，王彦2

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.山西医科大学第一医院

摘要：目的观察盐酸小檗碱对高糖高脂膳食联合链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)大鼠肠道菌群结构的影响，探讨其治疗糖尿病的可能机制。方法将雄性SD大鼠随机分为3组：正常对照组(对照组，n=6)、高糖高脂膳食联合链脲佐菌素(STZ)诱导DM组(DM组，n=6)、高糖高脂膳食联合链脲佐菌素(STZ)诱导DM加小檗碱干预组(小檗碱组，n=6)。小檗碱干预12周后，微生物平板菌落计数法测定各组大鼠结肠内粪便中大肠杆菌和双歧杆菌的数量，并测定大鼠体重、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)及血浆内毒素(LPS)水平，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果与对照组大鼠相比，DM组大鼠粪便中双歧杆菌数量降低，大肠杆菌数量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；DM组大鼠体重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR升高(P<0.05)。与DM组大鼠相比，小檗碱组大鼠粪便中双歧杆菌数量升高，大肠杆菌数量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；小檗碱组大鼠体重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR降低(P<0.05)。结论盐酸小檗碱可能通过改善肠道菌群结构从而降低高糖高脂膳食联合链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的血浆内毒素水平，改善其胰岛素抵抗程度，发挥降糖作用。

关键词：糖尿病；盐酸小檗碱；肠道菌群结构；空腹血糖；空腹胰岛素；内毒素

糖尿病(DM)与超重和肥胖，不合理的饮食结构，以及现代生活方式等密切相关。最新资料显示，我国成人糖尿病患病率为11.6%，而糖尿病前期人群已达50.1%[1]。目前研究证实，糖尿病是遗传因素和环境因素共同作用的结果，但其发病机制仍未完全阐明。近年研究发现肠道菌群可能在糖尿病的发病中发挥了重要的作用[2]。众所周知，盐酸小檗碱是治疗肠道细菌感染疾病的药物。研究提示，盐酸小檗碱对以胰岛素抵抗和慢性非特异性炎症为特征的2型糖尿病也有治疗作用[3]。本研究以高糖高脂膳食联合链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病SD大鼠为研究对象，观察盐酸小檗碱对高糖高脂膳食诱导的糖尿病大鼠肠道菌群结构的影响，并同步观察大鼠体重、血糖、胰岛素抵抗程度和血浆内毒素水平，探讨盐酸小檗碱治疗糖尿病的可能机制，为临床治疗策略提供新思路。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物健康雄性SPF级SD大鼠26只，鼠龄6周～8周，体重(180±20)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，清洁环境下饲养。普通饲料适应性喂养1周后随机分成两组：正常对照组(对照组，n=6)、高糖高脂膳食联合链脲佐菌素(STZ)诱导DM模型组(DM模型组，n=20)，对照组给予普通饲料喂养，由山西医科大学实验动物中心提供。DM模型组先予以高糖高脂饲料喂养，饲料由70%基础饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇+0.25%胆酸组成。两组均天黑前投食，自由饮水，喂养12周后，隔夜禁食8 h后腹腔注射链脲佐菌素，剂量为30 mg/kg，于鼠尾处取血测定大鼠空腹血糖(FBG)，每2 d进行一次，若FBG>7.8 mmol/L 则认为造模成功，如连续2次以上FBG<7.8 mmol/L 则认为造模失败。将造模成功的12只DM大鼠再次随机分成两组，即高糖高脂饮食联合链脲佐菌素诱导DM组(DM组，n=6)，高糖高脂饮食联合STZ诱导DM加小檗碱干预组(小檗碱组，n=6)。小檗碱组给予小檗碱150 mg /(kg·d)灌胃，以5%羧甲基纤维素钠溶解小檗碱。对照组和DM组大鼠均给予等体积的5%羧甲基纤维素钠灌胃。3组干预均持续12周。

1.1.2主要试剂与仪器蔗糖、胆固醇、胆酸：购自天津化工厂；深圳迈瑞GLU(葡萄糖氧化酶法)：购自深圳迈瑞公司；碘[125I]胰岛素放射免疫分析药盒：北京北方生物技术研究所；内毒素(Endotoxin，ET)鲎试剂显色基质试剂盒：购自厦门鲎试剂公司；盐酸小檗碱：购自北京中新制药厂(使用时用5%羧甲基纤维素钠溶解)；细菌培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；普通培养箱：上海博讯实业有限医疗设备厂生产；厌氧培养箱：上海精密仪器有限公司；KDC-1044低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；GC-1200γ放射免疫计数器：科大创新股份有限公司中佳分公司；迈瑞BS-300全自动生化仪：深圳迈瑞公司；血糖仪及试纸：强生公司；EP管等耗材：购自山西赛奥生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标本采集于实验第24周末，将大鼠禁食8 h，测定大鼠体重，25%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉大鼠，无菌环境下打开腹腔，经腹主动脉采血，分离血浆2 mL分装于无菌EP 管内，同时将部分血浆3 000 r/min离心15 min分离血清，上述标本冻存于-70 ℃冰箱。留取结肠内足量粪便待统一检测。

1.2.2血清指标检测上述血标本同批测定以下指标，鲎试剂显色基质法测血浆内毒素(LPS)，葡萄糖氧化酶法测空腹血糖，放免法测空腹胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.2.3粪便中双歧杆菌、大肠杆菌的检测取1 g粪便置于10 mL的无菌试管，用无菌生理盐水稀释至10 mL并在振荡器上混匀。将混匀液依次稀释为10-2～10-8的系列浓度梯度，分别用微量吸管吸取各稀释度的菌液50 μL(每个稀释度做3个平行样)涂布于相应培养基上(大肠杆菌采用EMB培养基，双歧杆菌采用BS培养基)。大肠杆菌在37 ℃恒温培养箱中培养，双歧杆菌先经厌氧系统处理后培养于37 ℃的恒温厌氧环境。选取菌落数在30～300，且微生物细胞均匀分散的平板，以每克粪便中的菌落形成单位(cfu/g)进行计数，结果用其对数值表示。

2结果

2.1各组大鼠双歧杆菌和大肠杆菌的变化盐酸小檗碱干预12周后，与对照组相比，DM组大鼠双歧杆菌数量降低，大肠杆菌数量增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与DM组相比，小檗碱组大鼠双歧杆菌数量增高，大肠杆菌数量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1　3组大鼠粪便中肠道菌群的数量(±s)　 cfu/g

2.2各组大鼠体重、空腹血糖、空腹胰岛素和血浆内毒素水平比较盐酸小檗碱干预12周后，与对照组大鼠相比，DM组大鼠体重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与DM组大鼠相比，小檗碱组大鼠体重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2　3组大鼠体重、FBG、FINS、LPS、HOMA-IR的比较(±s)

3讨论

近年来，我国居民饮食结构西化趋势明显，不仅增加了高饱和脂肪酸为主的肉类食物摄入量，同时也增加了蔗糖类食品的摄入。本研究选用高糖高脂膳食喂养的大鼠为研究对象，发现其肠道菌群结构发生了改变，与对照组大鼠相比，高糖高脂膳食喂养的大鼠肠道内双歧杆菌的数量降低，而大肠杆菌的数量升高。近年研究发现：饮食结构可影响哺乳类动物肠道内各菌属组成和数量，肠道菌群失衡与肥胖和糖尿病等相关代谢性疾病的发生有关[4-5]。研究证实：双歧杆菌可改善肠黏膜的屏障功能，而大肠杆菌可产生多种有害的代谢产物[6-7]。Cani等[8]提出的“代谢性内毒素血症”学说认为，各种致肠道菌群失调的因素使得肠道的通透性发生改变，肠道内细菌及其组分或代谢产物中的脂多糖入血量增加，机体呈现出慢性低度炎症状态，引起以胰岛素抵抗为特点的肥胖和糖尿病。本研究发现：与对照组大鼠相比，高糖高脂膳食喂养大鼠的肠道菌群结构发生改变，同时其体重、血浆LPS水平和HOMA-IR均显著增高，这一结论为代谢性内毒素血症学说提供了证据。

近年研究发现小檗碱可用于2型糖尿病的治疗，但机制尚未阐明。Lee等[9]研究提示：盐酸小檗碱可能通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和促进肌管细胞GLUT4 的转位发挥降糖作用。鉴于小檗碱在临床上长期用于治疗肠道感染性疾病，且不易经肠道吸收入血，血药浓度较低[10]，因此推测其可能通过调节肠道菌群结构发挥降糖作用。如果真是如此，小檗碱是否也可以改善血浆内毒素水平，从而减轻胰岛素抵抗程度。本研究发现：盐酸小檗碱干预12周后，与DM组大鼠相比，小檗碱组大鼠双歧杆菌数量显著增高，大肠杆菌数量显著降低；大鼠体重、血糖、LPS、HOMA-IR均显著降低。提示盐酸小檗碱可能通过改善肠道菌群结构从而降低高糖高脂膳食诱导的糖尿病大鼠的血浆内毒素水平，进而改善其胰岛素抵抗程度，发挥降糖作用。这一结论为盐酸小檗碱用于治疗糖尿病提供了新的思路和证据。然而本研究只检测了肠道中具有代表性的两种菌的变化，研究结果有一定的局限性。在进一步的研究中可不仅限于动物研究，还可以扩展到临床研究，并应用高通量测序技术等获得更可靠的研究数据和结论。

参考文献：

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[3]Zhang Q，Li Y，Chen L.Effect of berberine in treating type 2 diabetes mellitus and complications and its relevant mechanisms[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2015，40(9)：1660-1665.

[4]Delzenne NM，Cani PD.Gut microflora is a key player in host energy homeostasis[J].Med Sci(Pairs)，2008，24(5)：505-510．

[5]张静，吕毅.肠道菌群失调诱发2型糖尿病的研究进展[J].中国微生态学杂志，2016，28(1)：113-116.

[6]朱寅荣，李郑芳.双歧杆菌与2 型糖尿病的关系[J].医学综述，2015，21(17)：3186-3188.

[7]陈贵堂，赵霖，鲍善芬，等.不同植物蛋白质对大鼠肠道菌群的影响[J].中国食品学报，2006，6(1)：238-242.

[8]Cani PD，Bibiloni R，Knauf C，et al.Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia- induced inflammation in high-fat diet-induced obesity and diabetes in mice[J].Diabetes，2008，57(6)：1470-1481．

[9]Lee YS，Kim WS，Kim KH，et al.Berberine，a natural plant product，activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin-resistant states[J].Diabetes，2006，55(8)：2256-2264．

[10]Feng R，Shou JW，Zhao ZX，et al.Transforming berberine into its intestine-absorbable form by the gut microbiota[J].Sci Rep，2015，5(12)：1-15.

(本文编辑郭怀印)

通讯作者：王彦，E-mail：wyroad@126.com

中图分类号：R587.1R255.4

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.11.012

文章编号：1672-1349(2016)11-1221-03

(收稿日期：2016-01-06)