脑缺血/再灌注中柴胡皂苷d联合黄芩苷介导PARP-1对Th1/Th2平衡的影响

董利平，崔玉环，赵宝民，连晶晶，魏玉磊，颜　娟，郑茂东，刘占矿

(河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000)



脑缺血/再灌注中柴胡皂苷d联合黄芩苷介导PARP-1对Th1/Th2平衡的影响

董利平，崔玉环，赵宝民，连晶晶，魏玉磊，颜娟，郑茂东，刘占矿

(河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000)

[摘要]目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后给予柴胡皂苷d联合黄芩苷能否通过调控二磷酸腺苷核糖多聚酶-1(PARP-1)影响Th1/Th2细胞平衡进而发挥脑保护作用。方法将420只大鼠随机分成正常组、假手术组、模型组、PJ34组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组，每组60只。除正常组、假手术组外，其他组均采用改良Longa线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。术后2 h，PJ34组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组分别给予相应药物腹腔注射，正常组、假手术组、模型组给予等量生理盐水腹腔注射，均1次/d。于干预后24 h检测各组缺血脑组织体积，于干预后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h分别检测各组缺血脑组织中PARP-1聚合体蛋白表达量及INF-γ、IL-4含量，计算INF-γ/IL-4比值。结果各药物干预组的缺血脑组织体积均明显小于模型组(P均<0.05)，柴胡皂苷d+黄芩苷组缺血脑组织体积明显小于柴胡皂苷d组和黄芩苷组(P均<0.05)；干预后各时间点模型组PARP-1蛋白表达量及INF-γ/IL-4比值均明显高于假手术组及正常组(P均<0.05)，各药物干预组PARP-1蛋白表达量及INF-γ/IL-4比值均明显低于模型组(P均<0.05)，且各时间点柴胡皂苷d+黄芩苷组PARP-1蛋白表达量及INF-γ/IL-4比值均明显低于柴胡皂苷d组和黄芩苷组(P均<0.05)，但柴胡皂苷d+黄芩苷组与PJ34组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论柴胡皂苷d联合黄芩苷可能通过抑制PARP-1表达，维持Th1/Th2细胞平衡，从而实现对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。

[关键词]PARP-1；INF-γ/IL-4比值；柴胡皂苷d；黄芩苷；脑缺血再灌注损伤

柴胡皂苷d作为柴胡的主要药效成分，具有较高的活性，进入机体后主要分布在脑、心等组织器官，具有抗肿瘤、抗癌等作用[1]。黄芩苷是黄芩的主要活性成分，是由黄芩素与一分子葡萄糖醛酸结合形成的苷类化合物，具有抗氧化、清除氧自由基、抗炎、保护心脑血管及神经元等作用[2]。柴胡皂苷和黄芩苷单独应用对脑缺血再灌注损伤具有一定脑保护作用[3]，但柴胡皂苷d和黄芩苷联合用药是否对脑缺血再灌注损伤具有脑保护作用尚不明确。因此本研究探讨了大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后给予柴胡皂苷d联合黄芩苷能否通过调控二磷酸腺苷核糖多聚酶-1[Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]影响Th1/Th2细胞平衡进而发挥脑保护作用，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物与分组健康雄性SD大鼠462只，体质量(240±5)g，购自北京大学医学部实验动物科学部，动物合格证号：SCXK(京)2006-0008。随机将大鼠分成正常组、假手术组、模型组、PJ34组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组，每组66只。

1.2药物与试剂黄芩苷(Sigma-Aldrich公司)；柴胡皂苷d(Sigma-Aldrich公司)；PARP-1抑制剂PJ34(美国Santa Cruz公司)；栓线(北京沙东生物技术有限公司)，试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；大鼠IL-4、INF-γ细胞因子检测ELISA试剂盒(Biosource公司)；β-actin及PARP-1聚合体蛋白抗体(北京博奥森公司)。

1.3实验方法除正常组和假手术组外，其余组均采用改良Longa线栓法制作右侧大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，缺血2 h后拉出栓线，恢复血流，造模成功标志：右眼Horner征，向左侧倾倒或按逆时针方向转圈，左前肢内收屈曲。假手术组将栓线送至颈内动脉但不入颅，2 h后退回颈外动脉。术后2 h，各组采用腹腔注射每天早晨给药1次：PJ34组给予PJ34 25 mg/kg，柴胡皂苷d组给予柴胡皂苷d 70 mg/kg，黄芩苷组给予黄芩苷30 mg/kg，柴胡皂苷d+黄芩苷组给予柴胡皂苷d 70 mg/kg和黄芩苷30 mg/kg，正常组、假手术组及模型组给予等量生理盐水。

1.4观察指标

1.4.1缺血脑组织体积于干预后24 h，随机选取各组大鼠6只，快速断头取脑组织，等距离切取约2 mm的5个冠状面脑片，立即放入2%TTC染液，染色30 min，结果为红色是正常脑组织，不着色而呈白色为缺血脑组织，并在4%多聚甲醛中避光固定24 h，计算缺血脑组织体积。

1.4.2缺血脑组织中PARP-1聚合体蛋白表达情况采用Western blot技术检测。分别于干预后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每组各随机取6只大鼠，冰上取缺血脑组织，提取总蛋白，蛋白定量后，95 ℃水浴变性5 min，每孔上样200 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转膜2 h，封闭30 min(5%Blotto液)，加入PARP-1聚合体蛋白一抗(1∶3 000)，4 ℃摇床过夜，TBS-T洗膜3次，加入二抗(1∶5 000)，摇床孵育1 h，显色，以GAPDH为内参照，分析蛋白条带灰度值。

1.4.3缺血脑组织中INF-γ、IL-4含量及INF-γ/IL-4比值分别于干预后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每组各取6只大鼠，冰上取缺血脑组织，放入研钵中研磨，放入离心管4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液，置-20 ℃冰箱待测。按ELISA试剂盒内附说明书测定组织总蛋白溶解液中INF-γ、IL-4含量，计算INF-γ/IL-4比值(以该比值反映Th1/Th2细胞平衡状态)。

2结果

2.1干预后24 h各组缺血脑组织体积正常组和假手术组缺血脑组织体积均为0，模型组为(75.60±3.64)mm3，PJ34组为(55.42±3.71)mm3，柴胡皂苷d组为(65.22±2.38)mm3，黄芩苷组为(67.43±2.79)mm3，柴胡皂苷d+黄芩苷组为(57.09±2.27)mm3。各给药干预组缺血脑组织体积均明显小于模型组(P均<0.05)，柴胡皂苷d+黄芩苷组明显小于柴胡皂苷d组和黄芩苷组(P均<0.05)。

2.2各组干预后不同时间点缺血脑组织中PARP-1聚合体蛋白表达情况干预后各时间点模型组PARP-1蛋白表达量均明显高于假手术组及正常组(P均<0.05)，并随缺血再灌注时间延长呈动态变化，于24 h时达最高峰；各药物干预组PARP-1蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且各时间点柴胡皂苷d+黄芩苷组PARP-1蛋白表达量明显低于柴胡皂苷d组和黄芩苷组(P均<0.05)，但柴胡皂苷d+黄芩苷组与PJ34组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；假手术组和正常组均无明显变化。见表1。

2.3各组干预后不同时间点缺血脑组织中INF-γ/IL-4比值及与PARP-1的关系干预后各时间点模型组脑组织中INF-γ/IL-4比值明显高于假手术组及正常组(P均<0.05)；各药物干预组INF-γ/IL-4比值均明显低于模型组(P均<0.05)，且各时间点柴胡皂苷d+黄芩苷组INF-γ/IL-4比值明显低于柴胡皂苷d组和黄芩苷组(P均<0.05)，但柴胡皂苷d+黄芩苷组与PJ34组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；假手术组和正常对照组均无明显变化。见表2。

3讨论

PARP-1参与脑缺血再灌注的病理过程及其抑制剂的神经保护作用在体内、外实验中均得到直接证实[4]。相关研究显示，谷氨酸诱导的小鼠皮质神经细胞可迅速产生PARP-1，给予PARP-1抑制剂PJ34后拮抗了NO产生及谷氨酸所致的细胞损伤[5]；Goto等[6]报道，在大脑中动脉阻塞(MCAO)模型中，PARP-1-/-小鼠梗死面积的减小是因PARP-1基因缺陷所致，给予PARP-1抑制剂后梗死面积亦减小。

表1　各组干预后不同时间点缺血脑组织中PARP-1蛋白表达情况±s)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与柴胡皂苷d+黄芩苷组比较，P<0. 05。

表2　各组干预后不同时间点缺血脑组织中INF-γ/IL-4比值比较±s)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与柴胡皂苷d+黄芩苷组比较，P<0.05。

在血流再通的早期阶段，CD4+T细胞即参与了缺血再灌注损伤，T细胞活性被部分激活，可能是通过Th1细胞分泌某些促炎性因子(IL-2、IL-12、INF-γ、TNF-α等)导致组织损伤[7]，通过Th2细胞分泌某些抗炎性因子(IL-13、IL-5、IL-10等)保护脑缺血组织[8]。因此认为Th1/Th2细胞失衡与脑缺血再灌注损伤相关。从理论上讲，如果能够调节这种免疫失衡状态，就可以减少再灌注损伤，从而改善患者预后。Laudisi等[9]研究发现PARP-1在T细胞激活中发挥着重要的翻译调解作用，并与其参加Th1/Th2平衡密切相关，PARP-1缺乏可明显改变免疫反应中细胞因子及基因的表达。因而可以推测给予MCAO模型大鼠PARP-1抑制剂还可能通过影响Th1/Th2平衡而改善脑缺血再灌注损伤。

柴胡皂苷d具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤，抑制NF-AT、NF-κB激活的T淋巴细胞和AP-1信号，对抗增殖，调解内分泌及免疫系统作用[10]。黄芩苷具有抗炎、抗凋亡、免疫调节作用[11]。本研究证实大鼠短暂局灶性脑缺血再灌注后缺血脑组织中PARP-1蛋白表达显著增加，Th1/Th2细胞失衡，而给予PARP-1 抑制剂PJ34及柴胡皂苷d+黄芩苷干预后，PARP-1蛋白表达明显减少，Th1/Th2失衡显著改善，但柴胡皂苷d+黄芩苷组与PJ34组比较差异均无统计学意义，证实柴胡皂苷d及黄芩苷联合给药可减轻脑缺血再灌注损伤，推测其可能是通过抑制PARP-1表达，维持Th1/Th2细胞平衡实现对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。

[参考文献]

[1]李勇,刘进锴,林柳兵,等. 柴胡皂苷d对肝星状细胞ERα和ERβ蛋白水平的调节[J]. 中药新药与临床药理,2016,27(1):58-61

[2]王文娟,任欢欢,韩吉春,等. 黄芩苷抗脑缺血再灌注损伤的作用机制[J]. 中国实验方剂学杂志,2016,22(1):113-116

[3]李蓉,李振华,谌贝贝,等. 黄芩苷对全脑缺血/再灌注大鼠海马神经干细胞增殖和认知功能的影响[J]. 中国老年学杂志,2015,35(9):2322-2324

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[5]Radnai B,Antus C,Racz B,et al. Protective effect of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor PJ34 on mitochondrial depolarization-mediated cell death in hepatocellular carcinoma cells involves attenuation of c-Jun N-terminal kinase-2 and protein kinase B/Akt activation[J]. Mol Cancer,2012,11(10)：34

[6]Goto S,Xue R,Sugo N,et al. Poly(ADP-ribose) polymerase impairs early and long-term experimental stroke recovery[J]. Stroke，2002,33(4):1101-1106

[7]Xiong X,Barreto GE,Xu L,et al. Increased brain injury and worsened neurological outcome in interleukin-4 knockout mice after transient focal cerebral ischemia[J]. Stroke，2011,42(7):2026-2032

[8]Luo X,Kraus WL. On PAR with PARP:cellular stress signaling through poly(ADP-ribose) and PARP-1[J]. Genes Dev，2012,26(5):417-432

[9]Laudisi F,Sambucci M,Pioli C. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) as immune regulator[J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2011,11(4):326-333

[10] Wong VK,Zhang MM,Zhou H,et al. Saikosaponin-d enhances the anticancer potency of tnf-alpha viaovercoming its undesirable response of activating nf-kappa bsignalling in cancer cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013,2013:745295

[11] Lee W,Ku SK,Bae JS,et al. Anti-inflammatory effects of Baicalin,Baicalein, and Wogonin in vitro and in vivo[J]. Inflammation，2015,38(1):110-125

Effects of Saikosaponin d combined with baicalin on balance of Th1/Th2 in cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting the expression of PARP-1

DONG Liping,CUI Yuhuan, ZHAO Baomin, LIAN Jingjing, WEI Yulei, YAN Juan, ZHENG Maodong, LIU Zhankuang

(The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to study the neuroprotection effects of Saikosaponin d combined with baicalin pretreatment on cell balance of Th1/Th2 in cerebral ischemia-reperfusion injury rats whether by inhibiting the expression of Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1). Methods 420 rats were randomly divided into normal group, sham operation group, model group, PJ34 group, Saikosaponin d group, baicalin group and Saikosaponin d+baicalin group, each group had 60 rats. Cerebral ischemia-reperfusion injury model of rats was made by improved Longa suture method, in 2 h after operation,PJ34 group, Saikosaponin d group, baicalin group and Saikosaponin d+baicalin group were treated with respective drug by intraperitoneal injection once per day, while normal group, sham operation group, model group were given normal saline at the same time. The brain infarct volume were detected after prevention for 24 h, the expression of PARP-1 protein aggregates and INF-γ, IL-4 at different observation time point(after prevention for 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h),INF-γ/IL-4 was calculated. Results Compare to model group, the infarct volume in every treatment group was significantly smaller(P<0.05), while the volume of combination group was smaller than that in Saikosaponin d group, baicalin group (P<0.05).At every time point after prevention, the expression of PARP-1 and INF-γ/IL-4 in model group were all higher than that in normal group and sham operation group (P<0.05), and the indexes above in every treatment group were lower than that in model group (P<0.05), and at every time point, the indexes in combination group were lower than that in Saikosaponin d group, baicalin group (P<0.05), no significant difference was found between Saikosaponin d group and baicalin group (P>0.05). Conclusion Saikosaponin d combined with Baicalin has certain neuroprotection effects in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury, which probably implemented by inhibiting PARP-1 expression and maintaining the cell balance of Th1/Th2．

Key words:PARP-1; INF-γ/IL-4; Saikosaponin d; baicalin; cerebral ischemia-reperfusion injury

[作者简介]董利平，女，主任医师，主要从事脑血管病研究。 [通信作者]刘占矿，E-mail:lzk@163.com

[基金项目]河北省卫生厅科研基金项目(ZL20140035)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.005

[中图分类号]R743.33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)19-2066-04

[收稿日期]2016-01-25