ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究

党同学,张庆庆,汤文晶,程亚运

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)



ARTP诱变筛选匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究

党同学,张庆庆∗,汤文晶,程亚运

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

摘要:以匍枝根霉亚种点头根霉TP-02为原始菌株,利用ARTP诱变系统进行诱变处理．通过透明圈法进行初筛和摇瓶发酵进行复筛,获得一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶诱变菌株TZD-01,木聚糖酶活力达到280．81 U/m L,为原始菌株的2．7倍．通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察诱变菌株与原始菌株微结构特征变化,ARTP诱变处理可引起菌株形态特征发生改变．诱变菌株的菌落形态不规则,颜色为黑褐色,比原始菌株偏深;菌丝直径变大,形态更饱满;孢子形态规则更接近圆形,诱变筛选菌株的生长速度比原始菌株更快．

关 键 词:ARTP;匍枝根霉;木聚糖酶;扫描电子显微镜

木聚糖酶[1]主要由β-1,4-D-外切木糖苷酶和β-1,4-D-内切木聚糖酶构成,是能降解木聚糖为木糖和木寡糖的一组酶的总称．目前在食品、生物漂白、生物制浆、饲料等方面木聚糖酶使用广泛[2]．以匍枝根霉亚种点头根霉TP-02为出发菌株,该菌株具有生长周期短、不易染菌等特点,有利于诱变筛选出高产木聚糖酶菌株．利用ARTP[3]技术对该匍枝根霉进行诱变处理,诱变条件为通气量10 L/min、功率100 W、等离子体发射源与样品之间距离为2 mm．经过筛选得到一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶菌株,用电子显微镜和扫描电镜观察诱变筛选后菌株与原始菌株微结构特征变化,从而可提供一种从匍枝根霉诱变筛选高活力木聚糖酶的方法．

1 材料与方法

1．1 菌株与试剂

微生物发酵安徽省工程技术研究中心提供的匍枝根霉亚种点头根霉TP-02;木聚糖为桦木木聚糖, Sigma公司;其他试剂均为分析纯．

1．2 试验仪器与培养基

思清源生物科技有限公司ARTP诱变育种机;日立S-4800扫描电子显微镜(SEM)．

固体斜面培养基(PDA):葡萄糖20 g、琼脂20 g、马铃薯200 g、水1 L、自然p H;此培养基用于菌种保存和传代培养．

初筛平板培养基(g/L):琼脂20．0、NH4NO32．0、酵母膏5．0、MgSO4·7H2O 0．2、木聚糖10．0、K2HPO42．0、p H 7．2;此培养基用于菌种的透明圈测定[4]．

复筛培养基:10%麦麸浸出汁,p H自然．

复筛扩大培养基(发酵培养基):麦麸2%、玉米芯2%、(NH4)2SO40．3%、KH2PO40．2%、MgSO4· 7 H2O 0．2%、CaCl2 0．4%、吐温－80 0．05%,p H自然．

1．3 孢子悬浮液的制备

在无菌操作台中用无菌水从斜面上洗下孢子,经过棉花、漏斗进行过滤,在滤液中加入玻璃珠,摇床震荡2 h后,将梯度稀释后的孢子悬浮液分别滴到血球计数板上,通过显微镜记录孢子个数,按照血球计数板规格进行计算,将匍枝根霉菌株诱变前孢子悬浮液浓度稀释到106～107个/m L．

1．4 ARTP诱变和筛选方法

以1．3方法调整孢子悬浮液浓度,按照ARTP诱变系统的操作流程,以氦气作为工作气体,诱变条件为通气量10 L/min、功率100 W、等离子发射端与孢子悬浮液距离为2 mm,以诱变处理时间为可变参数,改变诱变处理时间可获得匍枝根霉菌株适宜的诱变条件[5],分别设定0、60 s、120 s、180 s、240 s、270 s、300 s、330 s、360 s为处理时间．诱变处理后的孢子悬浮液进行后培养,振荡形成新的菌悬液,在无菌操作台中分别进行梯度稀释,取100μL稀释液涂布平板,30℃培养48 h记录菌落数,并计算致死率:

致死率＝(U－T)/U×100%

式中,U为诱变前生长的菌落数;T为诱变后生长的菌落数．

初筛:匍枝根霉菌株孢子悬浮液经过ARTP诱变后,进行适当梯度稀释,分别在稀释后的孢子悬浮液中吸取100 u L,涂布到含有木聚糖的筛选培养基上,30℃培养48 h,采用刚果红法进行染色．通过透明圈法对诱变后菌株进行筛选,然后挑选出透明圈直径比菌落直径比值较大菌落进行复筛[6]．

复筛:在复筛培养基中接入初筛所得菌株,30℃、180 r/min培养24 h,再转接入复筛扩大培养基中,接种量10%、30℃、180 r/min培养5 d后测定酶活．

1．5 木聚糖酶活力测定

木聚糖酶活力的测定采用DNS法[7]．将发酵液在4℃、800 0 r/min的离心管中离心10 min,离心后取上清液作为粗酶液．520 nm处测定其吸光度,酶活力定义:在50℃、p H 4．6下,每分钟分解木聚糖产生1 umol木糖所需的木聚糖酶量为1个单位酶活力(U)．实验用DNS法测吸光值时,保持测得的吸光值在0．2～0．8之间．

1．6 匍枝根霉产木聚糖酶遗传稳定性实验

选育出高产突变株后,对其遗传稳定性进行研究,进行10次传代培养,并分别测定木聚糖酶活性．

取相同条件下培养的匍枝根霉诱变菌株和原始菌株平板进行试验,从平板上用接种环分别刮下少许匍枝根霉的菌丝,用乳酸石炭酸棉蓝染色,染色后进行制片,光学显微镜下观察菌体形态;从平板上用接种环分别刮下少许匍枝根霉的菌丝,置于滴有无菌水的盖玻片,进行固定,将固定好的菌体样品置于样品台上,用离子镀膜仪进行喷金,再用扫描电镜进行观察．

1．8 突变菌株与原始菌株发酵对比

以原始菌株作为对照,将诱变筛选的突变菌株进行发酵实验,在相同条件下进行培养,3组平行试验,每天测定酶活取平均值,并进行发酵对比,结果如表1所示．

表1 突变菌株与原始菌株发酵酶活力对比

图1 ARTP处理的匍枝根霉TP-02致死率曲线

2 结果与分析

2．1 致死率曲线

按照1．4方法利用CFU计算菌株的致死率,绘制出致死率曲线[8],结果如图1所示．由图1可知,随处理时间的延长,ARTP对匍枝根霉TP-02菌株的致死率明显增加．诱变处理180 s时,致死率超过85%;诱变处理240 s时,致死率达到93%;当诱变处理时间为360 s 时,致死率趋近100%．诱变处理致死率在90%左右时,诱变处理的效果较好[9],因此,采用240 s作为诱变处理时间,对匍枝根霉TP-02菌株进行诱变,此时的诱变致死率为93%．

2．2 初筛

按照1．4初筛的方法进行实验,采用透明圈法进行初筛,其中以H/D作为比值,H代表透明圈直径, D代表菌落直径,初筛获得32株菌株,结果如表2所示．

表2 初筛结果

2．3 复筛

第二，特色农产品质量无法保障，售后机制不完善。通过互联网销售特色农产品，不是简单的销售渠道的方面，更重要的是保证消费者收到质量高的农产品。很多消费者在进行区域特色农产品购买时候，当产品送达时，产品出现过期、与特色农产品不符等状况，同时，还无法便利进行售后，对平台造成不利影响。所以，要制定严格的质量标准，加大检查与执法力度，平台应不断完善相应的售后机制，提升消费者获得感、幸福感。

突变菌株与原始菌株相对突变比值如图2所示．由图2可知,出发菌株匍枝根霉TP-02经ARTP诱变处理,初筛出H/D比值较大的32株菌株进行复筛,每组摇瓶做3个平行实验,取酶活平均值．相同条件下,突变菌株酶活比上原始菌株酶活,所得比值即为相对突变比值,大于1为正突变,小于1为负突变,获得5株(编号为10、17、24、27、30)相对突变比值较大的突变菌株,分别命名为TZD-1、TZD-2、TZD-3、TZD-4、TZD-5．

图2 突变菌株与原始菌株相对突变比值

2．4 遗传稳定性实验

对获得的5株突变菌株进行连续10次传代培养,每代进行发酵实验并测定木聚糖酶活力,原始菌株作为对照组,获得一株遗传稳定的诱变菌株,遗传稳定性实验如图3所示．

图3 突变菌株遗传稳定性实验

2．5 ARTP诱变处理引起匍枝根霉菌落形态、色泽变化

诱变前后菌落的形态如图4所示．图4a为诱变后菌株TZD-01平板菌落形态,图4b为相同条件下原始菌株菌落形态．由图4可知,诱变后的菌株菌落形态呈现不规则,椭圆形菌落数量比原始菌株少,菌落直径比原始菌株大,色泽偏黑褐色,48 h已经形成较多褐色的孢子,由此说明诱变后的菌株生长速度加快．

图4 诱变前后菌落形态

2．6 400倍光学显微镜下观察诱变前后匍枝根霉孢子囊形态变化

400倍光学显微镜下匍枝根霉诱变前后孢子囊形态如图5所示．匍枝根霉形成孢子囊,囊內细胞质分裂形成多数孢子,孢子成熟后变为黑褐色、椭圆形,当孢子囊壁破裂时,孢子即散出．图5a和图5c为诱变后菌株孢子囊,图5b和图5d为相同条件下原始菌株孢子囊．由图5可知,从形态上观察,孢子囊均为椭圆形、呈多核状态,诱变后菌株孢子囊更偏圆形,且生长速度比原始菌株快,24 h孢子囊已成熟,孢子变为黑褐色,开始有孢子散出．

图5 400倍光学显微镜下匍枝根霉诱变前后孢子囊形态

2．7 扫描电镜下观察匍枝根霉菌体诱变前后形态变化

匍枝根霉特征是具有细长菌丝、不分隔,菌丝初期为白色,后转为灰色或褐色,诱变前后菌株扫描电镜图如图6所示．图6b、图6e、图6g、图6i为原始菌株扫描电镜图．由图6a、图6b可知,菌丝粗细均匀、形态饱满、笔直,直径约6～15μm;诱变后菌株菌丝直径稍大,孢子大多为椭圆形,稍有凹陷,直径约2～4μm．诱变后菌株菌丝附着孢子数量明显比原始菌株多,形态更接近椭圆,说明诱变后菌株生长更快,孢子发育更好;由图6c、图6d、图6e可以清楚观察到孢子囊的形态为椭圆形,含有大量孢子,图6c比图6e的孢子囊发育要成熟,已经开始有大量孢子散出,孢子囊周围出现许多散开的孢子,图6d比图6e的孢子囊更偏向椭圆,周围散落的孢子也偏多,说明诱变后菌株孢子囊成熟时间缩短;由图6f、图6h与图6g、图6i可知菌丝笔直、粗细较均匀,说明诱变后筛选菌株菌丝生长良好,遗传性状稳定．

2．8 突变菌株与原始菌株发酵对比

突变菌株与原始菌株发酵对比如图7所示．由表1和图7可以看出,在发酵第1 d时突变菌株酶活力为40．18 U/m L,原始菌株酶活力31．39 U/m L,两者酶活力大小相差不多;但从第2 d开始突变菌株酶活力达到90．27 U/m L,较原始菌株酶活力42．81 U/m L大小显著增加,比原始菌株酶活力增加速率高;到第4 d时酶活力大小开始缓慢增加,第5 d时达到最大值,与原始菌株一致,然后突变菌株酶活力开始下降;突变菌株在第5 d时最大酶活力达280．81 U/m L,是原始菌株的2．7倍,该菌株遗传稳定性较好,有利于进一步优化提高木聚糖酶活力．

3 结论

通过ARTP诱变处理匍枝根霉TP-02菌株,利用透明圈法进行初筛和摇瓶发酵进行复筛,获得一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶菌株TZD-01．该菌株进行发酵培养,5 d后测木聚糖酶活力可达到280．81 U/m L,为匍枝根霉诱变前菌株的2．7倍．利用光学显微镜和扫描电镜观察诱变筛选后菌体与原始菌株微结构特征变化,ARTP诱变处理匍枝根霉可引起菌株形态特征改变．诱变后筛选的突变菌株的菌落色泽变深偏黑褐色,形态不规则;菌丝直径比诱变前菌株大,形态更饱满;孢子形态比诱变前菌株规则,更接近椭圆,诱变筛选菌株的生长速度比原始菌株快．ARTP等离子体发射均匀,能够产生穿过细胞膜的活性粒子,进而在细胞内部对遗传物质造成损伤,导致基因发生突变[8]．在通气量10 L/min、功率100 W、等离子发射端与孢子悬浮液距离为2 mm条件下,通过实验确定匍枝根霉ARTP合适的诱变时间为240 s,可为进一步研究ARTP诱变筛选匍枝根霉产木聚糖酶提供参考．

图6 扫描电镜下匍枝根霉菌体诱变前后形态

图7 突变菌株与原始菌株发酵对比

参考文献:

[1] 方微,单玉萍,李峰,等．木聚糖酶的作用机理及其在饲料中的应用[J]．中国饲料,2011(21):21-24．

[2] K Taneja,S Gupta,R C Kuhad．Properties and application of a partially purified alkaline xylanase from an alkalophilic fungus aspergillus nidulans KK-99[J]．Bioresource Technology,2002,85(1):39-42．

[3] 祁田甜,张婵,胡济美,等．常压室温等离子体诱变技术选育高产Monacolin K紫色红曲霉突变株[J]．食品科学,2015, 36(9):66-70．

[4] 彭园花,卢红梅,曾祥钦．高产木聚糖酶菌株的诱变筛选及其产酶性质[J]．酿酒科技,2006(10):34-36．

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[7] M J Bailey,P Biely,K Poutanen K．Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]．Journal of Biotechnology,1992,23(3):257-270．

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[9] 薛刚,陈利娟,吴斌,等．ARTP诱变选育高温蛋白酶高产菌株及其酶学性质研究[J]．食品工业科技,2015,36(1):177-180．

Study on mutagenesis and screening by ARTP for improving Rhizopus stolonifer xylanase activity

DANG Tong-xue,ZHANG Qing-qing∗,TANG Wen-jing,CHENG Ya-yun
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Abstract:With Rhizopus stolonifer subspecies nod Rhizopus TP-02 as the starting strain,ARTP mutagenesis system was applied to mutagenic treatment．Primary screening by the method of transparent circle,then complex screening by shake flask fermentation,a stable xylanase producing strain TZD-01 was obtained．Xylanase activity reached 280．81 U/m L,2．7 times that of the original strain．The microstructure changes of the mutant strain and the original strain were observed by electron microscope and scanning electron microscope．ARTP mutation treatment can cause the changes of the morphological characteristics of the strain,irregular colony morphology of mutant strains,and the darker color than the original strain．After ARTP treatment,the mycelium diameter becomes larger,the shape is sounder,the spore morphology rule is closer to the circular,and the mutant strain grew faster than the original strain．

Key words:ARTP;rhizopus stolonifer;xylanase;scanning electron microscope

中图分类号:TS201．3

文献标识码:A

收稿日期:2015-10-16

基金项目:国家自然科学基金资助项目(31270135)

作者简介:党同学(1989-),男,安徽阜阳人,硕士研究生．

通讯作者:张庆庆(1954-),女,安徽怀宁人,教授,硕导．