超快速液相-质谱法同时测定液体奶和奶粉中磺胺和喹诺酮类药物残留*

闫正，任孟伟，张丽冰，布雅楠，杨照生，李挥

（1.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002； 2.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，石家庄 050091）



超快速液相-质谱法同时测定液体奶和奶粉中磺胺和喹诺酮类药物残留*

闫正1，任孟伟1，张丽冰1，布雅楠1，杨照生1，李挥2

（1.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002； 2.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，石家庄 050091）

摘要建立超快速液相-质谱联用法测定乳制品中磺胺和喹诺酮类药物残留的方法。试样加入乙腈沉淀蛋白，用0.22 μm滤膜过滤，经EndeavorsilTMC18柱分离，选用乙腈-0.1%甲酸为流动相。在0.05～100.00 μg/L范围内，17种兽药的质量浓度均与色谱峰面积均呈良好的线性，相关系数（r2）为0.990 6～0.999 8，方法检出限为0.05～0.10 μg/kg，加标回收率为75.88%～116.00%，测定结果的相对标准偏差为1.5%～13%（n=5）。该方法快速、灵敏，可以满足对乳制品中多种兽药残留的快速检测要求。

关键词超快速液相色谱-串联质谱法；磺胺；喹诺酮类；残留

磺胺类（SAs）和喹诺酮类（QNs）药物均为广谱抑菌药，因具有抗菌谱广、高效、价格低廉等特点，在畜牧水产等养殖生产中广泛使用［1］。磺胺类药物是人工合成的具有对氨基苯磺酰胺结构的一类抗菌药物的总称［2］，喹诺酮类是具有1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构的人工合成抗菌药物。磺胺类和喹诺酮类药物均具有抗原性，可诱导产生耐药性菌株甚至诱发癌症。有些养殖户法律意识淡薄，擅自加大用药量，不遵守休药期等，导致磺胺类和喹诺酮类药物的残留问题日趋严重［3］。

世界各国对SAs和QNs类药物残留非常重视，国际食品法典委员会（CAC）和欧美等许多国家规定，食品中SAs总量以及磺胺二甲嘧啶等单个磺胺的最大残留限量（MRL）不得超过0.10 mg/kg［4］。目前SAs和QNs药物的检测方法主要有酶联免疫法［5-6］、微生物法［7］、高效液相色谱-荧光法［8］、高效液相色谱法［9］、高效液相-串联质谱法［10］等。酶联免疫法和微生物法不能有效定性，高效液相法的检出限相对较低。液质联用具有良好的适用性、定性定量功能及高灵敏度，已成为药物残留检测的主要方法。笔者在总结文献方法的基础上，建立了17种兽药的高效液相色谱-三重四级杆质谱联用检测方法，缩短了分离时间，提高了工作效率，为乳制品的快速筛查提供了准确可靠的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：Q-TRAP 5500型，配有H-ESI源，美国AB公司；

UFLC液相色谱系统：LC-20AC型，日本岛津公司；

离心机：3K15型，德国Sigma公司；

涡旋仪：VORTEX GENIUS3型，德国IKA公司；

超声清洗仪：KQ-500E型，中国昆山市超声仪器有限公司；

电子天平：AB265-S型，瑞士梅特勒公司；

磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、氧氟沙星、磺胺甲噻二唑、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺喹恶啉、磺胺硝苯标准品：德国Dr. Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙 腈：色谱 纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；

甲酸：质谱纯，德国Sigma公司；

实验用水由Milipore纯水系统制备。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色 谱 柱：EndeavorsilTMC18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；柱温：室温；进样体积：2 μL；流量：0.3 mL/min；梯度洗脱：0.1～2 min B为5%，2～6 min B为5%～15%，6～11 min B为15%～20%，11～14 min B为20%～90%，14～16 min B为90%，16.1～19 min B为5。

1.2.2 质谱条件

扫描方式：正离子扫描；监测方式：MRM多反应监测；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：500℃；喷雾气压力：345 kPa（50 Psi）；辅助加热气压力：345 kPa（50 Psi）；气帘气压力：207 kPa （30 Psi）；碰撞气流速：中等。

1.3 标准溶液制备

分别称取17种抗生素标准品10.00 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成1 000 mg/L的储备液，于-20℃保存，可稳定保存6个月。

1.4 样品前处理

1.4.1 液体奶

准确称取5 g液体奶至离心管，加入5 mL乙腈，漩涡震荡1 min，在4℃条件下以5 000 r/min离心5 min，将上层清液转移至新离心管，原离心管中加入5 mL乙腈重复提取，合并提取液，取1 mL上清液经0.22 μm滤膜过滤后转移至样品瓶。

1.4.2 奶粉

准确称取1 g奶粉试样，加入4 mL超纯水溶解，后续处理步骤同液体奶。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

乳制品中含有的大量蛋白会影响液质分析的准确度，因此一般选择乙腈沉淀蛋白法。比较了样品与乙腈体积比为1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶3时兽药的回收率。当体积比大于1∶2时，兽药平均回收率普遍大于70%。因此选择样品与乙腈的体积比为1∶2。

2.2 LC条件优化

QNs的叔胺基与羧基官能团解离会被色谱柱中残留的硅羟基强烈吸附，造成峰形拖尾、色谱峰形异常及分离度降低等现象，所以色谱柱选择C18柱。酸性流动相可以降低残留的硅羟基对目标化合物中碱性基团的吸附作用。SAs类药物具有酸碱两性，当流动相的pH值较高或者不添加酸时，待测组分峰形较差。当流动相分别添加0.1%，0.2%甲酸时，分离结果相近。过低的酸度会影响色谱系统的使用寿命，故选择乙腈-0.1 %甲酸。因为测定兽药数量较多，采用梯度洗脱程序进行分离，在14 min内完成了对17种化合物的分析，见图1。

图1 17种兽药总离子流色谱图

2.3 MS条件优化

将1 mg/L的各标准溶液用针泵以5 μL/min的流量进样，在正离子模式下进行扫描，确定母离子和子离子，以MRM模式优化去簇电压DP和碰撞电压CE，使子离子在保证分辨率的条件下灵敏度最佳。以强度较大的子离子作为定量离子，强度稍小的作为定性离子，具体参数见表1。

表1 17种兽药的质谱条件及色谱参数

2.4 基质效应的评价

基质效应是指基质中的提取物干扰目标化合物的离子化，使目标化合物在仪器检测上的增强或抑制现象。基质效应会影响方法的检出限、定量限、准确度和精密度等［11］。基质效应=［（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率）-1］×100%［12］。在液体奶基质样品中有5种兽药出现了基质增强，在奶粉基质样品中有7种兽药出现基质增强，其余均为抑制效应。由于基质效应明显，故采用基质匹配外标溶液对样品中的兽药残留进行定量。

2.5 工作曲线方程与检出限和定量限

以空白基质配制0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 μg/L的系列混合标准溶液，分别进行测定。以被测组分的质量浓度（X ）对色谱峰面积（Y ）绘制标准曲线。以3倍信噪比的响应值对应的样品浓度作为方法检出限（LOD），以10倍信噪比计算定量限（LOQ）。工作曲线方程、检出限与定量限见表2。由表2可知，17种兽药均有良好的线性关系，相关系数（r2）为0.990 6～0.999 8，方法检出限为0.05～0.10 μg/kg，定量限为0.10～0.50 μg/kg。

表2 17种兽药线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 回收试验

根据欧盟兽药残留检测准则要求，平均回收率需在70%～120%之间，相对标准偏差（n=5）需小于20%［13］。在液体奶和奶粉中进行回收试验，分别考察10.00，20.00，50.00 μg/kg 3个加标水平下17种兽药的回收率，结果见表3。由表3可知，方法回收率为75.88%～116.00%，相对标准偏差为1.5%～13%，表明方法的精密度和准确度满足检测要求。

2.7 精密度试验

（1）仪器精密度。取10，100，1000 μg/kg的混合标准溶液，连续进样6次，计算各组分提取离子色谱峰（XIC）面积的相对标准偏差。（2）批内精密度。取1个空白样品平行制备6份，加入1 000.00 μg/kg的混合标准溶液，分别在3，6，9，12 h内进行LC-MS分析，计算各组分提取离子色谱峰（XIC）面积的相对标准偏差。（3）批间精密度。取3个空白样品，每个平行3份，加入1 000.00 μg/kg的混合标准溶液，连续测定3天，计算各组分提取离子色谱峰（XIC）面积的相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可知，兽药含量低的样品其测定结果的相对标准偏差较大，说明兽药含量对仪器精密度有影响；基质为牛奶和奶粉时，批内测定结果的相对标准偏差比批间的低，说明不同品牌的牛奶和奶粉之间存在差异。

表3 空白样品中17种兽药的加标回收率和相对标准偏差（n=5） %

表4 精密度试验结果（n=6） %

2.8 稳定性试验

考察浓度1 000.00 μg/kg的混合标液在常温条件下的稳定性，分别在4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h上机，计算各组分色谱峰面积的相对标准偏差在1.7%～9.3%之间，混合标液在48 h内稳定性符合检测要求，结果见表4。

2.9 实际样品测定

用所建方法对本地超市的30批不同批号和品牌的乳制品进行筛查，用已优化的色谱-质谱条件和前处理方法，根据碎片离子和保留时间等信息确证。其中3个样品检出磺胺硝苯，含量分别为0.18，0.16，0.05 μg/kg。

3 结语

建立乳制品中兽药的超快速液相-串联质谱联用定量分析方法，该方法能在14 min完成17种兽药的分析，方法检出限为0.05～0.10 μg/kg。三重四级杆质谱技术具有灵敏度和定量准确性，在乳制品兽药残留检测方面具有明显优势。该方法具有快速、简便、灵敏、绿色环保的特点，满足日常检测要求，适合食品检验行业对磺胺和喹诺酮类抗生素的检测。

参 考 文 献

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*河北省科技计划项目（15275505D）

联系人：闫正；E-mail： yanzh5165323@hbu.edu.cn

中图分类号：O657.7

文献标识码：A

文章编号：1008-6145（2016）01-0005-05

doi：10.3969/j.issn.1008-6145.2016.01.002

收稿日期：2015-09-08

Simultaneous Analysis of Sulfonamides and Quinolones in Milk and Milk Powder by UFLC-MS/MS

Yan Zheng1， Ren Mengwei1， Zhang Libing1， Bu Yanan1， Yang Zhaosheng1， Li Hui2
（1. College of Chemistry & Environmental Science， HeBei University， Baoding 071002， China；2. Hebei Key Laboraory of Food Safety， Hebei Food Inspecion and Research Institute， Shijiazhuang 050091， China）

AbstractSulfonamides and quinolones in milk products were determined by ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. The proteins in milk products were precipitated by acetonitrile，then cleaned by 0.22 μm millipore filter. The filtrate was separated on a EndeavorsilTMC18column by gradient elution with acetonitrile-0.1% formic acid as mobile phase. In the range of 0.05-100.00 μg/L， mass concentration of 17 veterinary drugs was linear with peak area with correlation coefficient （r2） of 0.990 6-0.999 8. The detection limit was 0.05-0.10 μg/kg. The recoveries ranged from 75.88% to 116.00%，and the relative standard deviations were in the range of 1.5%-13%（n=5）. The method is rapid and accurate，it can meet the requirements of monitoring of antibiotics in milk products.

KeywordsUFLC-MS/MS； sulfonamides； quinolones； residue