枸杞多糖对人恶性黑素瘤A375细胞黏附与侵袭的影响研究

马文宇，吴邓婷



·论著·

枸杞多糖对人恶性黑素瘤A375细胞黏附与侵袭的影响研究

马文宇，吴邓婷

810001青海省西宁市，青海大学附属医院皮肤科(马文宇)；青海大学研究生院临床医学(吴邓婷)

【摘要】目的观察枸杞多糖对人恶性黑素瘤A375细胞黏附与侵袭的影响。方法2013年5月—2015年12月，采用体外实验模型培养黑素瘤A375细胞，取对数生长期A375细胞，分别采用0、5、10、15 g/L浓度的枸杞多糖处理A375细胞，进行细胞黏附实验、细胞划痕实验以及细胞侵袭实验。观察不同浓度枸杞多糖对A375细胞黏附、迁移及侵袭的影响。结果不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞48 h后，A375细胞OD值比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖组A375细胞OD值均低于0 g/L枸杞多糖组(P<0.05)。5、10、15 g/L枸杞多糖组干预A375细胞48 h后，A375细胞黏附抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞24 h后，其与对应组0 h时划痕宽度比较，均变窄；且24 h时，5、10、15 g/L枸杞多糖组划痕宽度均宽于0 g/L枸杞多糖组。不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞48 h后，侵袭细胞数、侵袭力抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖组侵袭细胞数少于0 g/L枸杞多糖组，10、15 g/L枸杞多糖组侵袭细胞数少于5 g/L枸杞多糖组，侵袭力抑制率高于5 g/L枸杞多糖组(P<0.05)。结论枸杞多糖能在一定程度上抑制人恶性黑素瘤A375细胞的黏附、迁移和侵袭能力。

【关键词】黑色素瘤；枸杞；细胞黏附；细胞运动；侵袭

马文宇，吴邓婷.枸杞多糖对人恶性黑素瘤A375细胞黏附与侵袭的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(17)：2028-2032.[www.chinagp.net]

Ma WY，Wu DT.Effect of lycium barbarum polysaccharide on the adhesion and invasion of human malignant melanoma cells A375[J].Chinese General Practice，2016，19(17)：2028-2032.

恶性黑素瘤(malignant melanoma)好发于皮肤及黏膜，是一种相对常见的皮肤恶性肿瘤。据统计，继鳞状细胞癌、基底细胞癌之后，恶性黑素瘤居皮肤恶性肿瘤的第三位[1]。恶性黑素瘤恶性程度高，发生转移早，目前没有比较有效的治疗办法，因此针对其侵袭转移过程的研究有较大的意义。枸杞多糖是来源于中药植物枸杞的主要成分，具有多种生物活性[2]。其抗肿瘤作用的研究日益增多，但其对恶性黑素瘤侵袭力影响的相关研究鲜见报道。故本研究主要探讨枸杞多糖是否具有抑制人恶性黑素瘤A375细胞黏附、迁移和侵袭能力的作用，以期为其治疗提供依据。

1材料与方法

1.1材料枸杞多糖为青海省柴达木盆地的诺木洪红枸杞提取的精制多糖，人恶性黑素瘤A375细胞购自南京市凯基生物有限公司的原代细胞，血清为GIBCO澳洲胎牛血清，高糖DMEM培养基购于北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司，Matrigel基质胶购于BD公司，CCK-8试剂购于日本同仁研究所，96孔板、24孔板、6孔板、8 μm型Transwell小室购于Corning公司，HE染液购于Solarbio公司。相关仪器设备由青海省高原实验中心提供。

1.2方法

1.2.1A375细胞的培养2013年5月—2015年12月，根据南京市凯基生物有限公司提供的A375细胞培养说明书，使用含10%胎牛血清、pH值为7.4的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2的培养箱条件下培养A375细胞。根据细胞生长状态在超净工作台内进行换液、消化传代、冻存等操作。

1.2.2细胞黏附实验取对数生长期A375细胞，使用胰酶进行消化后，制成2.5×105个/ml细胞悬液。在6孔板进行实验铺板，每孔注入2 ml细胞悬液，将铺好的细胞板置于培养箱中进行培养，24 h后弃旧培养基，更换为2 ml的枸杞多糖培养基，浓度分别为0、5、10、15 g/L，在培养箱中孵育48 h后，使用胰酶消化各浓度组的细胞，计数后每组均制成3×105个/ml细胞悬液备用。于冰上在96孔板取3×4个孔，每孔铺Matrigel基质胶(按照说明书与无血清DMEM培养液以1∶3稀释)35 μl，置超净台内室温风干后，用2%BSA 20 μl进行封阻，于37 ℃培养箱中放置1 h。每组选3个铺胶孔，注入对应组的细胞悬液100 μl，将铺好细胞的96孔板置于培养箱中继续培养。1 h后磷酸盐缓冲液(PBS)洗去未黏附细胞，每孔加入90 μl无血清DMEM培养液和10 μl CCK-8试剂后再孵育4 h，上酶标仪检测每孔吸光度(OD值)。细胞黏附抑制率=(对照组OD值-处理组OD值)/对照组OD值×100%。

1.2.3细胞划痕实验用Marker笔在6孔板背后横向画3条间距0.7 cm的平行直线，备用。取对数生长期A375细胞，每孔以3×105个/ml的细胞悬液2 ml接种于6孔板中，培养24 h后细胞汇合率达90%以上，用200 μl枪头比着直尺在6孔板正中垂直于背后横线做划痕，轻吸弃去旧培养基，PBS轻轻洗2遍去除划下的细胞后，加入浓度分别为0、5、10、15 g/L枸杞多糖培养基(含血清1%，0.22 μm孔径的过滤器过滤)，立即于倒置显微镜下以划痕和横线相交的上下两处为监测点进行拍照，记作0 h时的结果。然后放入培养箱继续培养24 h，再进行各个监测点的拍照记作24 h时的结果。

1.2.4细胞侵袭实验Transwell小室底部为8 μm孔径聚碳酸酯滤膜，预先每个小室均匀铺上Matrigel基质胶(按照说明书与无血清DMEM培养液以1∶3稀释)50 μl，将小室置于24孔板内，放于37 ℃培养箱中培养1 h，小室底部Matrigel基质胶凝固。收集各浓度(0、5、10、15 g/L)枸杞多糖干预24 h后的A375细胞，再以含对应浓度的无血清枸杞多糖培养基制成2.5×105个/ml细胞悬液，取200 μl移入小室。然后将小室轻轻放入(以防产生气泡)加有500 μl含10%胎牛血清完全培养基的24孔板中，置培养箱内孵育。24 h后取出24孔板，以棉签小心擦除干净各小室滤膜上室面的细胞，吸净24孔板内培养液，均用PBS轻轻洗2遍。以4%多聚甲醛溶液固定小室下室面和24孔板内的细胞20 min，常规HE染色后晾干，将小室底面置于载玻片上使用倒置显微镜观察拍照。在400倍高倍镜下计数细胞，各浓度重复3孔，孔或膜随机6个视野，取平均值作为结果。侵袭细胞数=各下室面黏附的细胞数+相应24孔板黏附的细胞数，侵袭力抑制率=(对照组侵袭细胞数-处理组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%。

2结果

2.1不同浓度枸杞多糖组对A375细胞黏附力的影响不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞48 h后，A375细胞OD值比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖组A375细胞OD值均低于0 g/L枸杞多糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞48 h后，A375细胞黏附抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

Table 1Comparison of OD value and cell adhesion inhibition rate of A375 cells treated with different concentrations of LBP after 48 h

组别OD值细胞黏附抑制率(%)0g/L枸杞多糖组1.13±0.08-5g/L枸杞多糖组0.91±0.14a20.3±6.710g/L枸杞多糖组0.88±0.10a22.2±4.615g/L枸杞多糖组0.81±0.12a29.1±6.3F值4.7181.786P值0.0350.246

注：与0 g/L枸杞多糖组比较，aP<0.05；OD值=吸光度；-为无此数值

2.2不同浓度枸杞多糖组对A375细胞迁移的影响不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞24 h后，其与对应组0 h时划痕宽度比较，均变窄；且24 h时，5、10、15 g/L枸杞多糖组划痕宽度均宽于0 g/L枸杞多糖组(见图1，本文彩图详见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

2.3不同浓度枸杞多糖组对A375细胞侵袭力的影响不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞48 h后，其侵袭细胞数、侵袭力抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖组侵袭细胞数少于0 g/L枸杞多糖组，10、15 g/L枸杞多糖组侵袭细胞数少于5 g/L枸杞多糖组，侵袭力抑制率高于5 g/L枸杞多糖组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2、图2)。

Table 2Comparison of the number of invasion cells and invasiveness inhibition rate among A375 cells treated with different concentrations of LBP after 48 h

组别侵袭细胞数(个)侵袭力抑制率(%)0g/L枸杞多糖组66±10-5g/L枸杞多糖组42±9a36.9±3.810g/L枸杞多糖组28±4ab55.8±10.9b15g/L枸杞多糖组22±3ab65.7±8.2bF值23.5859.661P值<0.0100.013

注：与0 g/L枸杞多糖组比较，aP<0.05；与5 g/L枸杞多糖组比较，bP<0.05；-为无此数值

图1　不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞24 h时划痕实验结果

图2　不同浓度枸杞多糖组干预A375细胞48 h后Transwell小室侵袭实验结果(HE染色，×400)

3讨论

恶性黑素瘤是一种具有极强侵袭转移能力的黑色素细胞恶性肿瘤疾病，好发于富含黑色素细胞的皮肤及黏膜部位。据不完全的研究项目统计，恶性黑素瘤发病率占全部恶性肿瘤的1%～2%，成为继鳞状细胞癌、基底细胞癌之后的常见皮肤恶性肿瘤[3-4]。恶性黑素瘤为增长速率较快的恶性肿瘤种类之一，病死率也逐年增高[5-6]。在不同经济发达程度的地区，女性在恶性黑素瘤的发病率和病死率方面不同程度的低于男性[7]。从临床上关注的情况来看，恶性黑素瘤恶性程度高、转移迅速，前期被诊断出来的能力不足，医生和患者对恶性黑素瘤的认识不够，使得其仍然是严重危及我国人群健康的疾病之一[8]。

恶性黑素瘤的发病诱因以及具体的发病机制目前尚不十分清楚。相关研究表明，恶性黑素瘤的病因与种族、遗传、环境因素中的紫外线、个体易感性中的先天性痣、创伤和刺激以及其他因素，如服用避孕药和职业暴露等有关，对于病毒引起恶性黑素瘤，仅为早期研究较少时的一种推测[9-11]。恶性黑素瘤大致分为皮肤原发性恶性黑素瘤、黏膜性恶性黑素瘤和眼恶性黑素瘤三大类，其中皮肤原发性恶性黑素瘤为最常见类型，约占恶性黑素瘤的91.2%。其诊断主要依靠组织病理检查确诊，但随着现代科技的不断发展，在进行活检之前拥有多种可以辅助诊断的设备，如皮肤CT、皮肤镜、在体反射激光共聚焦显微镜等[12]。在恶性黑素瘤治疗方面，由于早期发现和诊断的能力不足，而且其侵袭能力较强，容易较早发生远处转移，手术和放疗达不到有效的治疗目的。因此应从抑制恶性黑素瘤发生侵袭转移的角度去研究可能的治疗方法。

侵袭、转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性之一，也是导致恶性肿瘤治疗效果不佳、患者预后差的主要因素。恶性肿瘤细胞发生侵袭转移，首要步骤是肿瘤细胞黏附至细胞外基质或基底膜，肿瘤细胞黏附分子与基质及相应的配体或受体结合，激活肿瘤细胞的信号通路、酶系统及运动系统，使细胞外基质发生降解、基底膜受到破坏，进而穿透至血管、淋巴管等，在多种细胞因子的作用下迁移到相应组织和器官形成转移灶[13-14]。在这样一个多步骤的复杂过程中，肿瘤细胞与基质或基底膜的黏附、细胞外基质和基底膜的降解、细胞运动迁移均是关键环节。若受到阻断，均有可能抑制肿瘤细胞发生侵袭转移[15]。

肿瘤细胞和细胞外基质黏附、肿瘤细胞间的黏附力降低使得肿瘤抵抗外界各种刺激的能力减弱，从而达到抗肿瘤作用。钙黏蛋白(cadherin)是一种具有调节细胞黏附作用的肿瘤细胞表面的重要黏附分子[16]。李璘等[17]采用不同浓度女贞子多糖作用于黑素瘤细胞后，分别进行了琼脂糖黏附实验、Matrigel胶黏附实验，PCR法检测其mRNA的表达。最后得出女贞子多糖能抑制黑素瘤细胞间、细胞与基质间的黏附以及抑制黑素瘤细胞表达黏附分子E-cadherin，并且这种抑制作用呈剂量依赖。在本研究中，0 g/L枸杞多糖组模拟的是A375细胞与基质的正常黏附情况，其他3个实验组在5、10、15 g/L浓度的枸杞多糖干预下，A375细胞OD值降低，即说明枸杞多糖能抑制人恶性黑素瘤A375细胞黏附力。在细胞划痕实验中，5、10、15 g/L浓度枸杞多糖干预A375细胞24 h后，其运动迁移距离较0 g/L组短，表明枸杞多糖能抑制恶性黑素瘤A375细胞的迁移运动能力。Matrigel基质胶是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，铺在Transwell小室底部的聚碳酸酯滤膜上，能在培养基中重建与天然基质膜结构极为相似的膜结构，从而可以模拟肿瘤细胞的侵袭过程。徐建亚等[18]采用Transwell小室侵袭实验发现，一定浓度鸡血藤对恶性黑素瘤细胞侵袭基底膜的能力有显著的抑制作用。本研究结果显示，侵袭并黏附至Transwell小室下室面的A375细胞随着枸杞多糖浓度增高而减少，提示枸杞多糖能抑制人恶性黑素瘤A375细胞的侵袭。

由于肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关，理论上可通过抑制其侵袭转移能力以减少肿瘤转移的发生，从而达到临床治疗的目的[19]。本研究结果表明，枸杞多糖能使恶性黑素瘤A375细胞的黏附、迁移与侵袭能力受到抑制，从而降低恶性黑素瘤发生转移的可能性。但其抑制机制有待进一步实验研究。

本研究要点：

本研究从肿瘤治疗和传统中药治疗相结合的角度，观察枸杞多糖作为干预药剂对恶性黑素瘤细胞生物学行为产生的影响，根据目前所了解的资料，本研究具有一定的创新性和研究意义。相应分子水平的侵袭转移机制一般包括各种酶、细胞因子和正负基因的调控等方面，而枸杞多糖作为一种天然植物成分的中医药剂，是否也通过这些机制发挥作用有待进一步研究。

作者贡献：马文宇进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；吴邓婷进行实验实施和统计学分析。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on the Adhesion and Invasion of Human Malignant Melanoma Cells A375

MAWen-yu，WUDeng-ting.

DepartmentofDermatology，theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity，Xining810001，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of lycium barbarum polysaccharide on the adhesion and invasion of human malignant melanoma cells A375.MethodsThe in vitro culture of human malignant melanoma cells A375 were performed from May 2013 to December 2015，and A375 cells at the logarithmic phase were taken.The A375 cells were treated with lycium barbarum polysaccharide of 0，5，10 and 15 g/L respectively.Cell adhesion assay，cell wound scratch assay and matrigel invasion assay were conducted.The influence of lycium barbarum polysaccharide of different concentrations on the adhesion，migration and invasion of A375 cells was observed.ResultsThere were significant differences in OD value after intervention for 48 h among the A375 cells treated with different concentrations of lycium barbarum polysaccharide(P<0.05)；5，10 and 15 g/L groups were lower than 0 g/L group in OD value(P<0.05).There were no significant differences in the adhesion inhibition rate after intervention for 48 h among 5,10 and 15 g/L group(P>0.05).A375 cells treated with different concentrations of lycium barbarum polysaccharide had narrower scratch width after intervention for 24 h，compared with that at 0 h；5，10 and 15 g/L groups had wider scratch than 0 g/L group at 24 h.A375 cells treated with different concentrations were significantly different in the number of invasion cells and invasiveness inhibition rate after intervention for 48 h(P<0.05)；5，10 and 15 g/L groups had lower number of invasion cells than 0 g/L group，10 and 15 g/L groups had lower number of invision cells and higher invasiveness inhibition rate than 5 g/L group(P<0.05).ConclusionLycium barbarum polysaccharide can inhibit the adhesion，migration and invasion of human malignant melanoma cells A375 to some extent.

【Key words】Melanoma；Lycium barbarum；Cell adhesion；Cell movement；Invasion

基金项目：青海省(应用)基础研究计划项目(2013-Z-731)

通信作者：马文宇，810001青海省西宁市，青海大学附属医院皮肤科；E-mail：mawenyu730126@163.com

【中图分类号】R 739.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.17.010

(收稿日期：2016-02-23；修回日期：2016-04-02)