Folin-Ciocalteu法测定金针菇多酚的条件优化

韩　伟，汪佳丹，徐　婷

(华东理工大学 药学院 中药现代化工程中心，上海　200237)



Folin-Ciocalteu法测定金针菇多酚的条件优化

韩伟，汪佳丹，徐婷

(华东理工大学 药学院 中药现代化工程中心，上海200237)

摘要：采用Folin-Ciocalteu法测定金针菇多酚，在单因素基础上，利用二次正交旋转组合设计，优化测定金针菇多酚含量的条件.结果表明，利用Folin-Ciocalteu法测定金针菇多酚含量的最佳条件：添加2 mL的福林酚试剂以及2.4 mL的15% Na2CO3溶液，反应时间为70 min，温度45 ℃，测定波长为730 nm.

关键词：金针菇；多酚；Folin-Ciocalteu法；二次正交旋转组合设计

金针菇(Flammulinavelutipes)隶属于真菌界(Eumycophyta)，为菌藻地衣类[1]，其性寒、味咸、滑润，归肝、胃、肠三经，具有利肝脏、益肠胃、增智慧和抗癌瘤等功效，食用和药用价值较高[2].金针菇活性成分的研究多集中于多糖类物质，而其所含多酚化合物的相关报道较少，因植物多酚是一类强活性的可再生资源，具有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等多种药理功效[3]，研究开发金针菇多酚具有一定的理论意义和实用价值.

目前，植物多酚的测定方法主要有高锰酸钾法、福林酚法(Folin-Ciocalteu method,FC法)、紫外分光光度法、普鲁士蓝法、酒石酸亚铁法、香草醛盐酸法等[4].因Folin-Ciocalteu法对仪器设备要求低，灵敏度及稳定性高，操作简便快速，在植物多酚含量测定的应用上最为普遍，但对于不同供试品的测定，Folin-Ciocalteu法的显色条件会有所差异[5-6]，即某显色条件体系对特定植物供试品显色灵敏而稳定，但运用于另一种植物多酚含量测定时却达不到应有的效果，这可能与不同植物所含多酚种类相关[7].本文考察了Na2CO3溶液质量分数和用量、福林酚试剂用量以及显色温度和时间对金针菇多酚显色后吸光度值的影响，并采用二次正交旋转组合设计对影响较大的显色条件进行参数优化，以期建立灵敏、稳定、准确且高效的测定金针菇多酚含量的Folin-Ciocalteu法，旨在为金针菇多酚提取纯化等工艺研究和进一步的开发利用提供参考.

1材料与方法

1.1材料与试剂

金针菇(鲜品)购自上海雪榕生物科技股份有限公司，自然阴干至恒重，避光保存备用；没食子酸对照品(质量分数≥99%)，J&K chemical百灵威科技有限公司；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；去离子水，上海华震科技有限公司；95%乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司.

1.2主要仪器与设备

AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；ER-692型微波提取装置，中国电子器件工业总公司；多功能高速粉碎机，江西赣云食品机械有限公司；UV1900PC型紫外-可见分光光度计，上海亚研电子科技有限公司；RJ-TGL-16C型台式高速离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司.

1.3金针菇多酚供试液的制备

准确称取80目金针菇干粉3.0 g于250 mL三口烧瓶中，加入50 mL70%乙醇溶液，轻摇至药材浸润，置于微波提取装置间歇提取3 min，于冷水浴中冷却后减压抽滤，相应溶剂定容于50 mL棕色容量瓶中，摇匀，6000 r/min离心8 min，即得金针菇多酚供试液.

1.4Folin-Ciocalteu法测定流程

精密移取适量供试液于25 mL棕色容量品中，依次加入2.0 mL去离子水和一定体积福林酚试剂，静置3 min后再加入Na2CO3溶液，迅速用去离子水定容至刻度，混匀后水浴静置一段时间，以去离子水作空白参比，在检测波长处测定并记录吸光度值，平行测定3次[8].

1.5检测波长的确定

分别移取适量对照品溶液和供试品溶液于25 mL棕色容量瓶中，按照1.4中测定方法依次加入试剂进行显色，用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描；同样条件下取适量对照品溶液和供试品溶液不加显色剂进行全波长扫描，记录扫描数据.

1.6条件优化试验

1.6.1单因素试验设计

分别单独考察Na2CO3质量分数(2%，3.5%，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，17.5%，20%)、Na2CO3溶液用量(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL)、福林酚试剂用量(0.2，0.5，0.8，1.1，1.4、1.7，2.0，2.3 mL)、显色温度(25，35，45，55，65 ℃)和显色时间(15，30，45，60，75，90，105，120，135，150 min)对金针菇多酚显色后吸光度值的影响.单因素试验条件如表1所示.

表1　单因素试验条件

1.6.2二次正交旋转组合试验设计

综合单因素试验结果，以福林酚试剂用量(X1)、15%Na2CO3溶液用量(X2)以及显色时间(X3)三个影响较大的因素进行试验设计并确定相应零水平值.以吸光度值(Y)作为响应值，采用二次正交旋转组合设计试验对显色条件进行优化.试验相关参数[9]：自变量p=3；二水平正交试验点mc=23=8；组合的星号臂值γ=2p/4=1.681 79且星号点试验共2p=6；由二次正交组合设计参数表查得，中心试验点m0=9，总试验数N=mc+2p+m0=23组.试验因素水平值及编码见表2.

表2　三元二次正交旋转组合设计因素水平编码表

2结果与分析

2.1最佳检测波长

比较对照品溶液与供试品溶液显色及不显色紫外可见光谱图(如图1)，可以看出金针菇多酚在显色与未显色情况下，均与没食子酸对照品溶液相同处理后的全波长扫描光谱图相一致.在显色反应后，供试液和对照品溶液在可见光区有一较为平缓的吸收峰，在730 nm处吸光度值最强，相比下未加显色剂的供试液及对照品溶液在可见光区不存在吸收，因此其他非目标组分在可见光区对多酚含量测定的干扰性小，选择730 nm作为Folin-Ciocalteu法的最佳检测波长.

2.2Folin-Ciocalteu法条件优化结果

2.2.1单因素试验

1)Na2CO3质量分数

测定中，多酚要被福林酚试剂氧化，需在弱碱性条件下解离成酚盐离子，当显色体系pH值与酚类pKa值相近时，多酚离子化程度大，反应迅速且完全[10]，Na2CO3被用于调节比色体系的酸碱环境，不同质量分数Na2CO3溶液的显色效果也不一.由图2及实验现象可知，Na2CO3质量分数小于5%时，显色液呈草绿色，显色效果不佳，当质量分数超过5%时，显色液呈深蓝色，吸光度值缓慢增大，质量分数为15%时吸光度值达到最大值，后呈下降趋势，考虑到高质量分数Na2CO3溶液易析出晶体从而影响分析，选择Na2CO3质量分数为15%.

2)Na2CO3溶液用量

图3为Na2CO3溶液用量对金针菇多酚显色后吸光度值的影响.由图可见：随着碳酸钠溶液用量的增加，吸光度呈先增大后降低趋势，当用量达到2 mL时吸光度值(0.4679)最大，说明显色反应比较完全；用量超过2 mL，碱性过强影响反应，吸光度值下降.综上，15%Na2CO3溶液用量选为2 mL.

图2　Na2CO3质量分数对金针菇多酚显色后吸光度值的影响

图3　Na2CO3溶液用量对金针菇多酚显色后吸光度值的影响

3)福林酚试剂用量

福林酚试剂作为显色剂，其用量对显色效果影响较大，如图4所示.随福林酚试剂用量增加，金针菇多酚显色后吸光度值呈先上升后降低趋势.当福林酚试剂用量为1.7 mL时，显色效果最好，再增加福林酚试剂用量，吸光度值下降，这可能是由于过大加入量使显色反应体系不稳定所造成的.因此，福林酚试剂用量选择为1.7 mL.

图4　福林酚试剂用量对金针菇多酚显色后吸光度值的影响

4)显色温度和时间

在一定温度下，供试液显色完全需一定时间，而升高温度可加速反应，促进特异性有色物质生成，且温度越高，达到最大吸光度值的时间越短.但温度过高将导致多酚类物质或显色生成物被破坏；而温度过低显色反应进行缓慢且显色不充分，均影响测定结果[11].

图5为温度和时间对多酚显色后吸光度值的影响结果，分析图5可知，温度低时显色缓慢，相同显色时间下吸光度值较小；温度较高时，显色迅速，但吸光度值随时间降低也较快，表明显色体系在高温下稳定性差.在25 ℃和35 ℃下，吸光度值随时间呈上升趋势，但在测定的150 min内还未达到最大吸光度值；在55 ℃和65 ℃下，约显色30 min，吸光度值即可达到最大，但其随时间降低的趋势也显著；45 ℃条件下的显色曲线最符合测定要求，反应进行到105 min时，吸光度值已趋于平稳，且在随后测定的45 min内保持稳定.

图5　温度和时间对多酚显色后吸光度值的影响

2.2.2二次正交旋转组合试验结果

1)试验方案及数据结果

综合单因素试验结果，选择对显色影响较大的因素——福林酚试剂用量(X1)、15%Na2CO3溶液用量(X2)及显色时间(X3)，采用二次正交旋转组合试验对条件参数进行优化，试验方案及数据结果见表3.

表3　三元二次正交旋转组合设计方案及结果分析

优化设计共有23个试验点，其中，1～8号为两水平正交试验，9～14号为星号点处试验，中心点试验为15～23号，用以估计试验误差.

2)模型建立与方差分析

表4　回归模型方差分析

3)模型各项显著性检验

表5显著性检验结果表明，一次项中Na2CO3溶液用量对模型影响极显著(P<0.01)，显色时间影响显著(P<0.05)，说明这两者为显色测定中的关键因素；福林酚试剂用量和Na2CO3溶液用量的交互项影响极显著(P<0.01)，Na2CO3溶液用量和显色时间交互项影响显著(P<0.05)，表明显色各因素间存在交互作用影响，不呈简单线性关系.通过比较模型一次项系数绝对值的大小来判断3个因素对金针菇多酚显色效果影响的主次性顺序为：Na2CO3溶液用量>显色时间>福林酚试剂用量.

表5　回归模型各项显著性检验

4)单因子效应分析

由于二次正交旋转组合试验满足正交设计要求，模型中各效应项可线性相加，偏回归系数彼此独立，可采用“降维法”进行分析[12]，即将回归方程中任意两因素固定于零水平，得到另一因素对吸光度值影响的关系曲线，如图6所示.图中，曲率幅度直观表现了各因素对多酚显色效果的影响程度，吸光度值随Na2CO3溶液用量的变化幅度最大，影响最显著，其次为显色时间，这与模型显著性检验结果相一致.

图6　单因子效应分析图

5)双因子交互作用分析

固定回归模型任一变量于零水平，由SAS 9.0软件处理另两变量间交互作用关系得等高线图及响应面图，如图7～9所示.等高线图及响应面图可直观反映两因素间交互作用的显著程度，等高线图中椭圆越扁平，两因素间的交互作用越显著，而在响应面图中，单一因素轴向的曲面越陡峭，曲率半径越大，则这一因素对响应值的影响越显著，并且在因素不同水平值下，另一因素的响应值变化程度的不同表明两者间交互作用显著.

在图7和图9中，X1X2和X2X3的等高线图呈扁平椭圆形，响应面图中，两两因素间在不同水平值下，响应值的变化程度不同，如X1X2响应曲面图中，当X1处于低水平时，响应值随X2的增大呈先增大后减小趋势，而X1处于高水平时，响应值随X2显著升高后呈小幅下降，这些变化均说明X1和X2以及X2和X3间的交互作用显著，而X1X3等高线图近乎圆形，表明交互作用不显著.

图7　福林酚试剂用量(X1)与Na2CO3溶液用量(X2)的交互作用

图8　福林酚试剂用量(X1)与显色时间(X3)的交互作用

图9　Na2CO3溶液用量(X2)与显色时间(X3)的交互作用

根据响应面图中因素轴向曲面的陡峭程度进行判断可知，3个因素对显色效果的影响由大到小依次为：Na2CO3溶液用量>显色时间>福林酚试剂用量.模型直观分析结果与显著性检验结果一致，进一步说明了各因素间的交互作用关系.

6)最佳显色条件的确定及验证

利用SAS 9.0软件对回归模型进行典型分析模拟寻优，得到最佳显色条件理论值，即经典型分析后得到一个稳定点以及最大临界响应值，如表6所示.

表6　回归模型典型分析

根据理论显色条件进行验证试验，考虑到实际可操作性，将验证显色参数微调为：福林酚试剂用量2 mL，15% Na2CO3溶液用量2.4 mL，时间70 min，验证所得吸光度值为0.6564±0.0059(n=3)，比表5中的最大理论值低1%，重复试验相对标准偏差小于2%，说明实际值与理论值相接近，该模型可较好模拟显色条件对金针菇多酚显色效果的影响，优化结果可用于实际含量测定.

3结语

1)经二次正交旋转组合设计对金针菇多酚显色条件进行优化，所得方差分析结果表明：模型拟合极显著(P<0.0001)，失拟项影响不显著(P>0.05)，说明所得回归模型对试验结果拟合度高，能代替真实试验点进行分析.由模型各项显著性检验结果结合单、双因子效应分析图谱可知，各因素对显色效果影响的主次性顺序为：Na2CO3溶液用量>显色时间>福林酚试剂用量，并且因素间存在一定交互作用，不呈简单线性关系.

2)由SAS 9.0软件对模型进行典型分析并经试验验证后得到最佳显色参数为：福林酚试剂用量2 mL，Na2CO3溶液用量2.4 mL，时间70 min.在此条件下金针菇多酚显色后吸光度值最大，可达0.6564±0.0059(n=3)，以此提高测定灵敏度.

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(编辑崔思荣)

Optimization on Determination Conditions of Polyphenol in

FlammulinVelutipesby Folin-Ciocalteu Method

HAN Wei,WANG Jiadan,XU Ting

(Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,School of pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract:The total polyphenol in Flammulina velutipes was determined by Folin-Ciocalteu method,and the stuitable chromogenic conditions for determination were optmized by quadratic orthogonal rotation combination design which was based on the single-factor experiments.Results showed that the optimum chromogenic conditions were as follows:2 mL Folin phenol reagent,2.4 mL 15% Na2CO3 at 45 ℃ for 70 min,and the detection wavelength was 730 nm.

Key words:Flammulina velutipes; total polyphenol; Folin-Ciocalteu method; quadratic orthogonal rotation combination design

收稿日期：2016-03-20

基金项目：国家自然科学基金资助项目(20006003);上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2012)第2-9号]

作者简介：韩伟(1968-)，男，教授，博士，博士生导师，主要从事天然产物的提取、分离及功能研究.

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1674-358X(2016)02-0026-09