辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞平衡在乙型肝炎病毒感染相关肝脏疾病进展中的作用研究

刘怀鄂，游 晶，陈红英，李鲜丽，陈 晓，兰 青，张茹薏



·论著·

辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞平衡在乙型肝炎病毒感染相关肝脏疾病进展中的作用研究

刘怀鄂，游 晶，陈红英，李鲜丽，陈 晓，兰 青，张茹薏

650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院感染科(刘怀鄂，游晶，陈红英，李鲜丽，兰青，张茹薏)，肿瘤治疗中心(陈晓)

【摘要】目的探讨辅助性T淋巴细胞17(Th17)/调节性T淋巴细胞(Treg)平衡在乙型肝炎病毒(HBV)感染相关肝脏疾病进展中的作用。方法选取2011年1月—2015年6月昆明医科大学第一附属医院收治的符合纳入与排除标准的HBV感染者111例，并依据《实用传染病学》中乙型肝炎轻、中、重度的诊断标准将患者分为A组23例(无症状慢性HBV携带者)、B组42例(轻中度慢性乙型肝炎患者)、C组18例(重度慢性乙型肝炎患者)和D组28例(乙型肝炎肝硬化患者)。同期选取本院体检中心体检健康者11例作为对照组。采用实时荧光定量系统测定HBV-DNA载量，采用流式细胞仪检测外周血中Th17、Treg表达率，计算Th17/Treg比值。结果A、B、C、D组HBV-DNA载量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。5组受试者Treg表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；A组Th17表达率、Th17/Treg比值及B组Th17/Treg比值均低于对照组(P<0.05)；B、C、D组Th17表达率、Th17/Treg比值均高于A组(P<0.05)；C组Th17表达率、Th17/Treg比值均高于B组(P<0.05)。HBV感染者Th17表达率为2.7%(3.2%)，Treg表达率为1.0%(1.2%)，HBV-DNA载量为66.0×104(1 206.7×104)copies/ml。Th17表达率与Treg表达率呈正相关(rs=0.201，P=0.026)；HBV-DNA载量与Th17表达率(rs=0.137,P=0.257)、Treg表达率(rs=-0.019，P=0.878)、Th17/Treg比值(rs=0.120，P=0.324)无直线相关关系。结论慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，且Th17/Treg比值较单一的Th17、Treg表达率可能更能准确地反映HBV感染相关肝脏疾病的进展程度。

【关键词】乙型肝炎病毒；乙型肝炎，慢性；T淋巴细胞，辅助；T淋巴细胞，调节性

刘怀鄂，游晶，陈红英，等.辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞平衡在乙型肝炎病毒感染相关肝脏疾病进展中的作用研究[J].中国全科医学，2016，19(18)：2121-2125.[www.chinagp.net]

Liu HE，You J，Chen HY，et al.Influence of the balance of Th17/Treg in the progress of hepatitis B virus related liver disease[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2121-2125.

乙型肝炎病毒(HBV)感染的慢性化和肝炎进展所导致的包括肝炎活动期、肝脏衰竭、肝硬化甚至肝癌的发生是困扰众多HBV感染者及临床医生的主要问题[1]。有临床研究显示，HBV感染者的临床结局与其机体免疫机制密切相关，尤其是T淋巴细胞，例如早期Th1/Th2细胞失衡学说[2]。但随着具有促进肝脏炎性反应的辅助性T淋巴细胞17(Th17)和具有抑制肝脏炎性反应的调节性T淋巴细胞(Treg)被人们所认识，Th17与Treg在HBV感染的慢性化和肝炎进展过程中的作用逐渐受到临床医生的关注。而Th17与Treg在HBV感染过程中的作用如何，尤其是Th17/Treg细胞平衡在HBV感染中的意义逐渐成为HBV感染慢性化和肝炎进展机制研究中的重点内容。本研究通过比较HBV感染导致的不同程度肝脏疾病患者及健康对照者外周血中Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值的变化情况，以了解Th17/Treg平衡在HBV感染相关肝脏疾病中的作用。

1对象与方法

1.1纳入与排除标准纳入标准：(1)符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎的诊断标准[3]；(2)未经抗病毒治疗。排除标准：(1)合并甲、丙、丁、戊型肝炎及免疫缺陷性疾病；(2)伴有肝癌、自身免疫性疾病、脂肪肝、酒精肝；(3)有吸毒史及毒物接触史。

1.2研究对象选取2011年1月—2015年6月昆明医科大学第一附属医院收治的符合纳入与排除标准的HBV感染者111例，并依据《实用传染病学》[4]中乙型肝炎轻、中、重度的诊断标准将患者分为A组23例(无症状慢性HBV携带者)、B组42例(轻中度慢性乙型肝炎患者)、C组18例(重度慢性乙型肝炎患者)和D组28例(乙型肝炎肝硬化患者)。同期选取本院体检中心体检健康者11例作为对照组。本研究经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准，受试者均知情同意并签署知情同意书。

本研究背景及创新点：

辅助性T淋巴细胞17(Th17)与调节性T淋巴细胞(Treg)在乙型肝炎病毒(HBV)感染相关肝脏疾病中的作用越来越受到医学界的关注,但究竟Th17/Treg平衡在HBV感染慢性化及HBV相关肝脏疾病进展中的作用如何，目前尚不清楚。本研究通过比较健康人群、不同疾病进展程度的慢性乙型肝炎患者外周血中Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值的差异和一系列相关性分析，证实了慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，Th17/Treg比值较单纯的Th17、Treg表达率能够更为准确地反映HBV感染相关肝脏疾病的进展程度。

1.3方法

1.3.1一般资料记录受试者的性别、年龄、乙型肝炎家族史、HBV-DNA载量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)；采用全自动生化分析仪奥林巴斯AU-5400及配套试剂检测ALT水平，参考范围0～40 U/L；按照上海科华生物工程股份有限公司HBV-DNA试剂盒说明书提取所有受试者DNA，裂解扩增后在实时荧光定量系统中测定HBV-DNA载量。

1.3.2Th17、Treg表达率检测采集受试者清晨空腹静脉血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC)备用。每1×106个细胞加入佛波酯(PMA，SIGMA公司)50 ng/ml、离子霉素(Ion，SIGMA公司)1 μg/ml，并在含高尔基蛋白转换抑制剂的1640培养基中刺激5 h。以250×g离心5 min后，将重悬的细胞按流式细胞仪检测试剂盒(BD公司)要求进行固定、染色、透化处理〔Th17采用白介素17(IL-17)细胞内染色，Treg细胞采用叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)细胞内染色〕，标记后的细胞采用流式细胞仪检测，并采用Diva软件分析Th17、Treg表达率，计算Th17/Treg比值。

2结果

2.15组受试者一般资料比较5组受试者性别、乙型肝炎家族史比较，差异无统计学意义(P>0.05)；A、B、C、D组HBV-DNA载量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；5组受试者年龄、ALT水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。D组年龄高于对照组及A、B组，差异有统计学意义(P<0.05)；B、C、D组ALT水平均高于对照组和A组，差异有统计学意义(P<0.05)；C组ALT水平高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组ALT水平低于C组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1　5组受试者一般资料比较

注：-表示无此项；HBV=乙型肝炎病毒，ALT=丙氨酸氨基转移酶；与对照组比较，aP<0.05；与A组比较，bP<0.05；与B组比较，cP<0.05；与C组比较，dP<0.05；e为χ2值，f为F值，余为H值

2.25组受试者Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值比较5组受试者Th17表达率、Th17/Treg比值比较，差异有统计学意义(P<0.05)；5组受试者Treg表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。A组Th17表达率、Th17/Treg比值及B组Th17/Treg比值均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；B、C、D组Th17表达率、Th17/Treg比值均高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；C组Th17表达率、Th17/Treg比值均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表25组受试者Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值比较〔M(QR)〕

Table 2Comparison of the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg among the five groups

组别例数Th17表达率(%)Treg表达率(%)Th17/Treg比值对照组113.6(3.9)0.6(1.6)5.5(4.8)A组231.0(1.5)a1.0(1.2)0.8(1.4)aB组422.9(3.8)b1.0(1.0)2.9(3.7)abC组183.9(4.3)bc1.1(1.0)4.0(4.2)bcD组283.3(3.4)b0.9(1.1)2.9(4.3)bH值31.1003.06128.250P值<0.0010.548<0.001

注：Th17=辅助性T淋巴细胞17，Treg=调节性T淋巴细胞；与对照组比较，aP<0.05；与A组比较，bP<0.05；与B组比较，cP<0.05

2.3相关性分析HBV感染者Th17表达率为2.7%(3.2%)，Treg表达率为1.0%(1.2%)，HBV-DNA载量为66.0×104(1 206.7×104)copies/ml。Th17表达率与Treg表达率呈正相关(rs=0.201，P=0.026)；HBV-DNA载量与Th17表达率(rs=0.137,P=0.257)、Treg表达率(rs=-0.019，P=0.878)、Th17/Treg比值(rs=0.120，P=0.324)无直线相关关系。

3讨论

近年来，肝脏炎性反应在HBV清除、HBV感染相关性肝脏疾病进展中的作用受到越来越多的关注，一定程度上反映了肝脏炎性反应在肝炎-肝硬化-肝癌进程中的重要意义[5-6]。Franzese等[7]分析了慢性乙型肝炎患者和感染了HBV恢复后的患者外周血中的CD4+CD25+Treg在体外对CD8+T淋巴细胞的影响，发现去除CD4+CD25+Treg后PBMC中的CD8+T淋巴细胞的数量增加且功能增强，证实了CD4+CD25+Treg通过抑制CD8+T淋巴细胞而起到免疫调节作用。随后的相关研究指出，Th17在HBV感染过程中会促进肝脏炎性反应[8-9]。国内外多数研究认为，Treg表达率的升高可以减轻肝脏炎性反应，同时与HBV感染的慢性化存在一定关系[10-12]。而Th17具有明显的促进肝脏炎性反应的作用，Treg能够抑制Th17发育[13]。但也有研究认为，单纯的Treg表达率升高，肝脏Foxp3表达升高并不能完全抑制白介素(IL)-23/IL-17炎性通路[8]。Pyzik等[14]在研究中还发现Treg在IL-1、IL-23及IL-21的作用下可以转变为Th17。Th17/Treg细胞失衡在HBV感染的相关肝脏疾病纤维化进展中可能发挥了促进作用，较高的Th17/Treg比值与肝脏纤维化呈正相关[15]。因此，Th17/Treg平衡在HBV感染慢性化及HBV相关肝脏疾病进展中的意义可能远大于单独的Treg表达率或Th17表达率的变化。

本研究结果显示，D组年龄大于对照组及A、B组，提示年龄可能是HBV感染的肝脏疾病进展阶段中的重要相关因素，尤其是肝硬化患者，随其HBV感染时间越长，肝硬化的发生风险相应增大。A组Th17表达率低于对照组，B、C、D组Th17表达率均高于A组，C组Th17表达率高于B组，提示HBV感染的相关肝脏疾病中，Th17是调控肝脏炎性反应程度的主要细胞,肝脏疾病的严重程度与Th17表达率可能存在一定关系。但观察健康者和无症状慢性HBV携带者的Th17表达率和ALT水平发现，其ALT水平与Th17表达率的高低并不完全一致，健康者Th17表达率明显高于无症状慢性HBV携带者，但ALT水平却并未见明显升高，说明单纯依靠Th17表达率无法推断HBV感染肝脏疾病的进展程度，而较低水平的Th17可能是HBV感染慢性化的原因之一。本研究中虽然各组间Treg表达率并无差异，但Th17/Treg比值却存在差异，且A、B组Th17/Treg比值均低于对照组，B、C、D组Th17/Treg比值均高于A组，C组Th17/Treg比值均高于B组，提示Th17/Treg比值并不是HBV感染后是否慢性化和相关肝脏疾病进展程度的唯一决定因素。本研究相关性分析结果显示，Th17表达率与Treg表达率呈正相关，HBV-DNA载量与Th17表达率、Treg表达率、Th17/Treg比值无直线相关关系，表明Treg细胞在肝脏炎性反应的调控中起隐匿调控作用，而Th17/Treg比值更能够准确地反映HBV感染相关肝脏疾病的进展程度。相关临床研究显示，慢性乙型肝炎患者Treg表达率较健康者明显升高，且与HBV-DNA载量呈正相关[7，10-11]。但亦有研究结果显示，慢性乙型肝炎患者Treg表达率与HBV-DNA载量无直线相关关系[16-17]，本研究结果与之一致。分析研究结果不一致的原因除了界定Treg的标志不一致外(部分研究采用CD4+CD25+界定Treg，部分研究采用CD4+CD25+Foxp3+来界定)，也可能与慢性乙型肝炎患者不同监测时间点的即时免疫状态有关[18]。

综上所述，Th17、Treg是调控HBV感染相关肝脏疾病的重要细胞，但单独的Th17或Treg均不能完全反应HBV感染者的临床结局或者与之相关的肝脏疾病进展程度；Th17/Treg比值较Th17或Treg能够更准确地反映HBV感染相关肝脏疾病的进展程度；慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，但Th17/Treg失衡可能并不是导致HBV感染慢性化和相关肝脏疾病进展的唯一因素。

作者贡献：刘怀鄂、游晶进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；陈红英、李鲜丽、陈晓、兰青、张茹薏进行试验实施、评估、资料收集；游晶进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Influence of the Balance of Th17/Treg in the Progress of Hepatitis B Virus Related Liver Disease

LIUHuai-e，YOUJing，CHENHong-ying，etal.

DepartmentofInfectiousDisease，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of the balance of Th17/Treg in the progress of hepatitis B virus(HBV) related liver disease.MethodsFrom January 2011 to June 2015,we enrolled 111 patients with HBV infection who accorded with inclusion and exclusion criteria from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University.Base on the diagnostic standards of HBV in Practical Infectious Diseases,all the patients were divided into four groups:group A(23 patients with asymptomatic chronic HBV carriers),group B(42 patients with mild-moderate chronic hepatitis B patients),group C(18 patients with severe chronic hepatitis B) and group D(28 patients with hepatitis and hepatic cirrhosis),and we also enrolled 11 healthy people who received treatment in the physical examination center in the hospital in the same period as control group.Realtime fluorescent quantitative system was used to determine HBV-DNA load,and flow cytometry was employed to detect the expression rates of peripheral Th17 and Treg and Th17/Treg.ResultsGroup A，group B，group C，group D were not significantly different in the HBV-DNA load (P>0.05).The 5 groups were not significantly different in the expression rate of Treg (P>0.05);group A was lower than control group in the expression rate of Th17 and Th17/Treg,and group B was lower than control group in Th17/Treg (P<0.05);group B,group C and group D were higher than group A in the expression rate of Th17 and Th17/Treg (P<0.05);group C was higher than group B in the expression rate of Th17 and Th17/Treg (P<0.05).For the all patients with HBV infection,the expression rate of Th17 was 2.7%(3.2%),the expression rate of Treg was 1.0%(1.2%),and HBV-DNA load was 66.0 × 104(1 206.7 × 104) copies / ml.The expression rate of Th17 was positively correlated with the expression rate of Treg(rs=0.201，P=0.026);HBV-DNA load had no linear correlation with the expression rate of Th17(rs=0.137,P=0.257),the expression rate of Treg(rs=-0.019，P=0.878),and Th17/Treg(rs=0.120，P=0.324).ConclusionThe imbalance of Th17/Treg maybe a common phenomenon in patients with chronic HBV infection，and the ratio of Th17/Treg can more accurately reflect the progress of HBV infection-related liver disease than the expression rate of Th17 or Treg alone.

【Key words】Hepatitis B virus；Hepatitis B,chronic;T-lymphocytes,helper；T-lymphocytes,regulatory

基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2011FZ121)

通信作者：游晶，650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院感染科；E-mail：jingyoukm@126.com

【中图分类号】R 373.21

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.002

(收稿日期：2016-03-09；修回日期：2016-05-06)

·专题研究·