胃癌组织miR-9的表达及其与临床病理的关系

余丹纯　聂玉强　贾　林　黄耀星　孙小娟

广州市第一人民医院消化内科(广州 511457)



胃癌组织miR-9的表达及其与临床病理的关系

余丹纯聂玉强贾林黄耀星孙小娟

广州市第一人民医院消化内科(广州 511457)

【摘要】目的观察miR-9在胃癌组织中的表达水平及其与临床病理的相关性。方法采用实时荧光定量PCR方法分别检测28例胃癌及正常胃组织中miR-9的表达水平，并分析其表达情况与临床病理资料的关系。结果胃癌组织miR-9的表达水平[0.0078(0.0031～0.0142)]显著低于相应正常胃组织[0.0177(0.0084～0.0311),P<0.05]，尤其是伴淋巴结转移者[0.0021(0.0006～0.0685)]miR-9表达水平明显降低。结论胃癌组织中miR-9低表达，且与胃癌淋巴结转移有关。

【关键词】胃肿瘤临床病理学逆转录聚合酶链反应miR-9

微小RNA(miRNA)是真核生物中一类22个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上具有高度保守性，能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因m-RNA降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，作为一类潜在的癌基因或抑癌基因发挥作用[1-3]，成为近年研究的热点。多个研究发现，miR-9在神经肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、结直肠癌、淋巴瘤等肿瘤的发生、发展和转移中起重要作用[4-10]。由于miRNA具有组织特异性，不同细胞来源的肿瘤可能会有不同的miRNA上调或下调[11]，目前尚未有关于miR-9表达与胃癌关系的研究报道，本研究拟探讨miR-9在胃癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的相关性。

1资料与方法

1.1标本收集广州医科大学附属广州市第一人民医院2012年11月—2013年11月外科手术切除并经病理确诊的28例胃癌患者，所有患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗。手术标本取新鲜胃癌及远离癌灶至少5cm的正常黏膜组织各1块，冲洗干净后立即置于液氮中保存。正常黏膜组织进行病理学检查未见癌细胞浸润。

1.2临床资料采集所有入组患者的临床资料，包括性别、年龄、影像学检查(CT或MR)、术中所见及术后病理结果。其中男21例，女7例，平均年龄(58.3±13.1)岁；高分化腺癌3例，中分化腺癌9例，低分化腺癌16例；伴淋巴结转移19例，无淋巴结转移9例；按照胃癌TNM分期方法：Ⅰ期2例，Ⅱ期6例，Ⅲ期9例，Ⅳ期11例。

1.3总RNA的提取鉴定和cDNA合成及保存将100 mg组织于液氮中研碎，加入1 mL Trizol(美国 Invitrogen)，按照说明书提取RNA后用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，并行电泳鉴定，置于-80°C保存备用。每个标本分别取2 μg总RNA，按照miRNA逆转录试剂盒(EXIQON)说明书操作合成第一链cDNA，合成cDNA置于-20°C保存备用。

1.4引物设计及合成在miRNA Base数据库和Gene Bank数据库中查找miR-9及内参基因U6的基因序列，使用primer-Express 2.0软件设计引物，由EXIQON公司合成。miR-9上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3′。U6上游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物：5′-GGAACG-CTTCACGAATTTG-3′。

1.5qRT-PCR检测miR-9的表达水平按照qRT-PCR试剂盒(丹麦 EXIQON)使用说明书，在MJR option 2荧光定量PCR仪上同时进行标准品及样品U6及miR-9表达水平测定。反应条件：95°C 5 min预变性，然后95°C 10 s，62°C 45 s，72°C 10 s，共40个循环。根据标准曲线，实时定量PCR仪直接计算出每一样品各基因的表达量(每个标准品及样品均作3个复孔，取平均值进行数据分析)。为了校准标本间RNA治疗和逆转录效率差异，对每一样品检测所得miR-9的表达量进行标准化。miR-9标化表达量=同一份标本miR-9表达量/U6表达量。

2结果

2.1总RNA的鉴定每份组织标本提取的总RNA浓度5～11 g/L，A260/A280值均在1.85～2.00之间。紫外线下在1%琼脂糖凝胶上可见28S、18S、5S 3条带，28S和18S的亮度比约为1.5∶1～2∶1，5S条带比较淡，见图1。表明提取的总RNA纯度高，降解少，可用于后续实验。

2.2miR-9的表达水平癌组织中miR-9中位表达量0.0078(0.0031～0.0142)显著低于相应正常胃组织0.0177(0.0084～0.0311)(Z=-2.733,P=0.008)。

2.3胃癌组织中miR-9表达与临床病理特征的关系miR-9的表达下调与患者年龄、性别、肿瘤分化程度和TNM分期无关(P>0.05)，与淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

图1　组织总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图

3讨论

胃癌(Gastric Cacinoma)是最常见的消化道恶性肿瘤，占全球癌症死亡原因的第二位。尽管近年来治疗手段不断改进，早期胃癌5年生存率可达90%，但晚期胃癌5年生存率仅为14%，其治疗效果取决于肿瘤大小、分期、病理类型、侵袭和转移等。因此，寻找特异性的分子标记物，对明确早期肿瘤的生物学特性，实施针对性治疗有着重要意义。

近年来miRNA在人类恶性肿瘤性疾病中的作用受到高度的重视。在肿瘤组织中染色体常发生缺失、增加或重排现象，而miRNA位于染色体的脆性位点，因此异常表达的miRNA可能在肿瘤形成中扮演重要角色，可能是控制细胞增殖和凋亡的抑癌基因或致癌基因[12-13]。miRNA表达的改变可以导致遗传信息表达的改变从而导致相应的病理生理状态，而处于一定病理生理状态的组织常伴有特定的miRNA表达[14]。对肿瘤miRNA表达的研究有助于多种癌症的分型和预后判断[15]。寻找并研究特异性的miRNA及其靶基因的表达有助于胃癌的分型和预后判断，可为治疗提供新的思路。

表1　胃癌组织中miR-9表达与

注：M(Q25～Q75)分别是miR-9标化表达量的中位数及上下四分位数，*P<0.05

人miR-9有23个核苷酸，有3种类型：miR-9-1、miR-9-2和miR-9-3，分别定位于1q22、5q14.3、15q26.1，具有促癌和抑癌双向调节作用，在不同细胞来源的肿瘤组织其表达及作用不尽相同。多项研究发现，miR-9在神经肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、结直肠癌、淋巴瘤等肿瘤的发生、发展和转移中起重要作用[4-10]。NASS D等[4]还发现miR-9在原发性脑肿瘤中表达明显上调，而在其他脑转移瘤中表达明显下调，对于区别是否原发性脑肿瘤具有重要的意义。而在宫颈癌患者中，miR-9的表达与其生存率有关[6]。目前尚未有关于miR-9在胃癌组织中表达情况的报道。

本研究发现，胃癌组织miR-9的表达水平显著低于相应正常胃组织，通过对miR-9的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移进行相关性分析发现，伴淋巴结转移者miR-9表达水平明显下调，提示miR-9低表达与胃癌的侵袭和转移有关。miR-9低表达也与黑色素瘤[16]和食管癌的侵袭、转移有关，提示miR-9可以作为评估侵袭能力的指标。人类肿瘤组织CpG岛启动子区域甲基化是抑癌miRNA表达缺失的重要机制之一[17]，而表达miR-9的三个基因座位均具有CpG岛。在恶性黑色素瘤中可见到miR-9基因位点高甲基化现象[18]，胃癌组织中miR-9表达下调表达也可能与miR-9的异常甲基化有关，有待我们更进一步的研究证实。

总之，胃癌组织中miR-9低表达，且与淋巴结转移有关，是一有潜在价值的特异性miRNA，可能为将来胃癌的靶向治疗提供新方向。

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The correlation between miR-9 expression and clinicopathology in gastric carcinoma

YuDanchun,NieYuqiang,JiaLin,etal.

DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between the level of miR-9 expression and clinicopathology in gastric carcinoma.MethodsThe expression of miR-9 in 28 cases of gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues were detected by quantitative real-time PCR, and the relationship between the expression and clinicopathology was analyzed.ResultsThe expression of miR-9 expression in gastric carcinoma tissues [0.0078(0.0031～0.0142)] was significantly lower compared with the corresponding normal gastric tissues [0.0177(0.0084～0.0311),P<0.05], especially in lymph node-invasive carcinoma [0.0021(0.0006～0.0685)].ConclusionmiR-9 was down regulated in gastric cancer tissues, which was significantly associated with lymph node metastasis.

【Key words】Gastric neoplasms; Clinicopathology; Reverse transcriptase polymerase chain reaction; miR-9

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.03.003

(收稿日期：2015- 02-15)