体外纯化方法对脂肪颗粒细胞活性的影响

赵玉坤,于冬梅,罗 赛,刁志勇,吕远东,郝立君



实验研究

体外纯化方法对脂肪颗粒细胞活性的影响

赵玉坤,于冬梅,罗 赛,刁志勇,吕远东,郝立君

目的 探讨纯化方法对自体脂肪移植存活率的影响。方法 抽取10例腹部吸脂患者的脂肪颗粒，按不同离心速度和时间分组纯化，通过组织形态学观察、葡萄糖转移实验等对比脂肪颗粒细胞活性的体外差异，并通过动物实验观察植入后脂肪组织体积、质量的变化。结果 在离体情况下，离心对脂肪细胞的活性有影响；而实验动物各组在移植物残留体积和质量上的差异并无统计学意义。结论 离心纯化方法在降低纯化脂肪的时间、提高纯化效率方面优于静置纯化方法，且对体内存活率无明显影响，临床上值得推广。

脂肪移植； 细胞活性； 体外纯化； 葡萄糖转移实验； 离心

近年来，自体脂肪移植在整形外科领域的应用较广泛，关注术中每一个步骤以提高移植后脂肪的存活率一直是学者们讨论的热点[1-6]。脂肪的纯化是脂肪移植术中重要的步骤，学者们采用的纯化方法并不一致。目前最常用的是静置法和离心法，自2014 年5月至 2014年 12月，笔者比较了2种方法的体内和体外差异，以期指导纯化方法在临床中的选择及应用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机选取于齐齐哈尔医学院附属第一医院医疗美容科行腹部脂肪抽吸术患者的脂肪标本，共 10例，均为女性;年龄 35～42岁。均获得患者的知情同意。

1.2 脂肪抽吸与分组 常规活力碘消毒，铺巾。在下腹部抽吸区域同条件抽吸脂肪颗粒细胞。抽吸后针头向下静置10 min，缓慢向下推出下层肿胀液体。用生理盐水漂洗3次。等量分5组：A组静置30 min、B组1000 r/min离心2 min、C组3000 r/min离心2 min、D组2000 r/min离心1 min、E组2000 r/min离心5 min。分组处理后留取中间饱满颗粒脂肪层。

1.3 计数完整脂肪细胞百分比 显微镜下选取脂肪组织完整的部位，在高倍镜(×400)下计数500个脂肪细胞。

1.4 组织形态观察 每组脂肪组织分别经OCT包埋后，制作冰冻切片，用显微镜观察组织形态差异。

1.5 葡萄糖转移实验检测脂肪细胞活性 同条件获取脂肪颗粒300 ml，分组纯化后留中层脂肪颗粒为样本，每组样本搅匀，分别注射入8个无菌培养皿中，每皿5 ml，每个培养皿中加入10 ml含糖(15 mmol/L)无血清的DMEM，加1 U胰岛素，同时设4个空白标本(含糖无血清DMEM，不含脂肪颗粒)，共计12个培养皿。摇匀后置入37℃，5% CO2恒温培养箱孵育，1 h后取下层清液，用生化分析仪测定其中葡萄糖的浓度，并与空白对照组比较，二者的差值即是每个标本内颗粒脂肪细胞葡萄糖转移量，葡萄糖转移量的多少代表此标本内脂肪细胞活性的高低。4个空白标本的平均葡萄糖浓度为基础浓度,基础浓度与实验标本葡萄糖浓度的差值为实验标本葡萄糖转移量[7]。

1.6 动物实验 雌性Wistar大鼠18只，体质量(200±20) g，月龄2.5个月。由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。取大鼠腹股沟皮下脂肪按“1.2”中A组静置30 min、C组3000 r/min离心2 min、E组2000 r/min离心5 min处理后，分别注入大鼠背部皮下1 ml，每组6只,标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。常规饲养12周后处死。取出移植物测量质量和体积。

2 结果

2.1 完整脂肪细胞百分比 各组完整脂肪细胞百分比见表1，经方差分析F=2.01，P=0.1093，各组间差异无统计学意义。

表1 各组完整脂肪细胞百分比Tab 1 Percentage of intact lipocytes in each group

2.2 组织形态学观察 A组：细胞壁完整，可见尚未发育成熟的脂肪细胞，细胞间纤维较多，脂肪细胞无变形(图1a)；B组：细胞形态有挤压、变形，细胞壁基本完好(图1b)；C 组：细胞受挤压较明显，呈现细胞影，细胞壁有破溃(图1c)；D 组：脂肪细胞基本完好，部分细胞壁受挤压、有破裂(图1d)；E组：部分细胞壁明显受挤压、有破裂，可见细胞融合(图1e)。

图1 各组脂肪细胞组织学形态(HE ×400) a.A组 b.B组c.C组 d.D组 e.E组
Fig 1 Histological morphology of adipose tissue in each group (HE ×400). a.group A. b.group B. c.group C. d.group D. e.group E.

2.3 葡萄糖转移量 各组葡萄糖转移量见表2。经方差分析F=47.46，P<0.001，差异有统计学意义。SNK两两比较显示，除了C组和E组之间差异无统计学意义，其他各组之间差异均有统计学意义。

表2 各组葡萄糖转移量Tab 2 Glucose transfer in each group

注：a,b,c,d字母相同表示两组间差异无统计学意义，字母不同表示差异有统计学意义

2.4 移植物残留体积和质量 各组移植物残留体积方差分析结果为F=0.11，P=0.9008，各组间差异无统计学意义；各组移植物残留质量方差分析结果为F=0.12，P=0.8909，各组间差异无统计学意义(表3)。

表3 各组移植物残留体积和质量Tab 3 Residual volume and mass of graft in each group ±s

3 讨论

近年来已有文献报道，脂肪颗粒细胞移植后估计有最高达70%的脂肪被吸收[3]。重视术中的任何一个步骤都有可能提高移植后脂肪的存活率。而体外纯化脂肪颗粒细胞是移植脂肪术中的必要步骤，目前的方法也并不统一。有学者采用静置法，认为此种方法不会破坏脂肪细胞的活性，但很难完全析出混杂的血液、麻醉液、组织间液、破碎脂肪及纤维组织碎块等，且纯化效率低；有学者采用离心法，认为离心可以提高纯化效率，析出杂质较完全，可以得到高纯度的脂肪颗粒，但是，速度大于600 r/min的离心便会降低脂肪细胞活性，学者们选择的离心速度与时间也是各有不同[1-2,8-9]。因此，本实验比较静置与离心纯化后的脂肪颗粒细胞活性及动物体内存活情况是有必要意义的。

本实验结果显示，完整脂肪细胞百分比各组间差异无统计学意义，提示离心速度与时间对脂肪细胞完整性并无明显影响(转速过大、时间过长的情况除外)。镜下组织学切片观察可见，高的离心速度(C组)和长的离心时间(E组)与较低的速度(B组)和较短的离心时间(D组)相比，在脂肪细胞挤压变形上还是有组织学差异的，前者脂肪细胞壁受压情况要更加明显一些(图1b～e)。同样可观察到各离心纯化组较静置组的脂肪细胞均有不同程度的变形。

葡萄糖转移试验中，离心纯化后脂肪颗粒的葡萄糖转移量随着速度和时间的增加而降低，并且均低于静置组，说明离心的确会降低脂肪颗粒的活性，且速度和时间越大，对其活性的影响会越大(适当范围内)。

近年来，又有学者提倡静置保留适当的血液成分，认为其中可能含有的生长因子及相关成分将有利于移植后脂肪的存活。因此为比较降低活性的脂肪颗粒细胞在移植后的存活率是否会明显低于静置组脂肪细胞，本实验又设计了动物实验，实验结果显示游离脂肪颗粒在移植入大鼠体内12周后，无论是体积还是质量上，3组并没有明显区别。分析其原因，不排除植入体内后的脂肪细胞活性可能复苏，由于植入体内的脂肪颗粒细胞的转归受体内病理生理、免疫、分子生物等多种因素的影响，脂肪颗粒在体内的转化和存活情况异常复杂[10-12]。即使在体外实验中脂肪颗粒细胞的活性受到了影响，但在体内实验中受影响的脂肪颗粒细胞在存活情况上并没有表现出明显劣势，而临床上最终观察的指标是脂肪细胞在体内存活的情况。

笔者认为，离心纯化虽然在体外条件下会降低脂肪颗粒细胞的活性，但其体内存活率并不低于静置情况，就纯化效率和时间成本来讲，离心可以大大缩短纯化脂肪的时间，提高纯化效率；但就纯化成本而言，由于离心机及耗材的使用也将增加临床的经济投入。故本实验旨在为临床上选择纯化方法提供一定的实验依据，而两种方法的移植脂肪远期存活情况有无区别仍需进一步探究。

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Effects of purification methods on the cytoactive factors of lipochondria in vitro

ZHAOYu-kun,YUDong-mei,LUOSai,DIAOZhi-yong,LYUYuan-dong,HAOLi-jun.

(PlasticandCosmeticDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

HAOLi-jun,Email:lijunhao368@163.com

Objective To investigate the effects of purification methods on the survival rate of autologous fat grafting.Methods Lipochondria obtained from 10 patients undergoing abdominal liposuction were grouped and purified at different rotation speeds and times.The in vitro differences in cytoactive factors of the lipochondria were compared by histomorphological observation and glucose shift experiment and so on,and the changes in volume and weight of the postgrafted adipose tissues were observed by animal experiment.Results In vitro,centrifugation had significantly different effects on the activity of adipose cells,while the differences in volume and weight showed by laboratory animals in different groups were not statistically significant.Conclusion Centrifugal purification surpasses standing purification in decreasing the time for fat purification and elevating purification efficiency,but there is no effect on the survival rate in vivo.It is worthy of clinical application.

Fat graft; Cytoactive; Purification in vitro; Glucose transportation test; Centrifugation

150001 黑龙江 哈尔滨,哈尔滨医科大学附属第一医院 整形美容中心

赵玉坤(1983-),女，黑龙江勃利人，医师，硕士.

郝立君，150001,哈尔滨医科大学附属第一医院 整形美容中心，电子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.018

R318;R-332

A

1673-7040(2016)06-0378-03

2016-02-05)