富血小板凝胶对金黄色葡萄球菌的体外抗菌性研究

赵连前,张 宇,回 蔷,郭冰玉,常 鹏,陶 凯



实验研究

富血小板凝胶对金黄色葡萄球菌的体外抗菌性研究

赵连前,张 宇,回 蔷,郭冰玉,常 鹏,陶 凯

目的 探究人体富血小板凝胶(PRG)对金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用；对比观察不同浓度富血小板凝胶对金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用。方法 分别取20例健康志愿者外周静脉血30 ml，制备不同浓度富血小板凝胶,血小板浓度依次为1.8×1012/L(PRG1组)、1.2×1012/L(PRG2组)、0.6×1012/L(PRG3组)。通过体外抗菌实验观察不同浓度PRG在甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)溶液中孵育1、2、4、8、12、24 h后的抗菌效果。结果 在孵育开始后，各浓度PRG菌落计数明显少于PBS对照组，PRG对MRSA和MSSA均有明显的抗菌作用(P<0.05)，各浓度PRG抗菌作用均在孵育2 h后最明显，随后逐渐下降；同一时间PRG1、PRG2和PRG3的抑菌率依次下降，与其含血小板浓度呈正相关关系，各组间菌落计数差异均有统计学意义(P<0.05)。在孵育12 h后，细菌生长进入稳定期，各组抑菌率明显下降，各组菌落计数差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在一定时间内，PRG对MSSA和MRSA均有明显的抑制作用，PRG的抗菌作用与血小板浓度呈正相关关系。

富血小板凝胶； 抗菌肽； 抗菌作用； 金黄色葡萄球菌； 体外研究

近年来，随着金黄色葡萄球菌耐药性的产生和耐药菌株增加，控制其感染逐渐成为临床一大难题。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是自体全血经梯度离心、分离得到的血小板浓缩物。PRP与激活剂按一定比例混合，即得富血小板凝胶(platelet rich gel，PRG)。PRG中因含有大量高浓度生长因子，能促进创面修复和组织再生，现已作为一种新兴的治疗方法，广泛应用于促进骨折愈合[1-2]、脂肪移植[3-5]、面部年轻化[6-9]等整形外科领域，且取得了良好的临床效果。但PRG抗菌机制还有待进一步研究。自2015年6月至2015年12月，沈阳军区总医院整形外科通过体外实验探究健康人不同浓度的PRG对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌作用，以期为PRG应用于临床治疗感染提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 主要试剂

甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌菌株(MSSA)ATCC25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)ATCC43300(沈阳军区总医院检验科提供)；哥伦比亚血培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；凝血酶冻干粉(一格制药有限公司)；氯化钙(国药集团)。

1.2 主要仪器及工具

ELITIST 5K-R低速冷冻离心机(长沙市鑫奥仪器仪表有限公司)，XT 1800i全自动血细胞分析仪(日本希森美康)，恒温箱(日本三洋公司)，densicCHEK plus比浊仪(法国梅里埃公司)，一次性无菌真空采血管(广州阳普医疗科技股份有限公司)，移液器(德国EPPENDORF公司)，15 ml无菌离心管。

1.3 研究对象

健康志愿者20例。男性10例，女性10例；年龄18～35岁，平均(27.4±3.4)岁。志愿者纳入标准：近6个月内未服用抗炎药、抗生素；未行免疫抑制治疗；无任何系统疾病；无癌症既往史和吸烟史；血红蛋白浓度不低于110 g/L，血小板数量1.5×1011～2.5×1011/L。采血后的样品随机匿名编号。所有志愿者均自愿参与本研究并签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.4 实验方法

1.4.1 PRP制备 取健康志愿者血液30 ml，用2步离心法提取PRP、贫血小板血浆 (platelet-rich gel，PPP)，2次离心的条件分别为：25℃、1400 r/min、离心15 min和25℃、3500 r/min、离心10 min。测定PRP、PPP浓度后，将PRP分为3份，用PPP将PRP中血小板浓度依次稀释为1.8×1012/L(PRG1组)、1.2×1012/L(PRG2组)、0.6×1012/L(PRG3组)。1000 IU凝血酶冻干粉中加入1 ml氯化钙，混匀制备激活剂。在使用前，将PRP与激活剂以4∶1的比例混合，并匀速搅拌。

1.4.2 体外抗菌实验 在生物安全柜中，用接种环将实验菌株ATCC 25923，ATCC 43300接种在哥伦比亚血琼脂培养基上，(34±1)℃恒温培养16 h。用无菌棉签取1个菌落，加入含 3 ml PBS的试管中，摇匀，(34±1)℃恒温孵育2 h。用PBS配制0.5麦氏浓度菌悬液，金黄色葡萄球菌浓度大约是1.5×108CFU/L，并将此稀释为2×106CFU/ml。将200 μl 2×106CFU/ml MSSA、MRSA悬液分别加入200 μlPBS及不同浓度PRG中，放入(34±1)℃恒温箱。分别于1、2、4、8、12、24 h依次取样并稀释，取100 μl涂布平板，将平板放入(34±1)℃恒温箱培养，18 h后观察并记录各平皿菌落数。

1.4.3 抑菌率的计算 绘制时间-抑菌曲线图，计算各实验组和PBS对照组相比减少的细菌比例，即抑菌率。实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌体外抑菌实验

不同浓度PRG对MSSA、MSSA抗菌效果如图1，2所示，呈先上升后下降趋势。孵育开始后各浓度PRG中的菌落计数开始下降，2 h达最低点，此时抗菌效果最明显，随后菌落计数开始上升，直至12 h后细菌生长进入稳定期，PRG1、PRG2、PRG3组菌落计数在12 h内组间差异均有统计学意义(P<0.05)；PBS组菌落计数在孵育开始即呈对数上升，12 h后趋于平稳，细菌生长进入稳定期。各浓度PRG组菌落计数在12 h内均低于PBS组，各时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)，即PRG组在12 h内有抗菌性；在同一时间点各PRG组菌落计数由高到低依次为PRG3、PRG2、PRG1，各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。12 h后各浓度PRG菌落计数比较差异无统计学意义(P<0.05)，生长趋势平稳，细菌生长进入稳定期。

2.2 不同浓度PRG在不同时间的抑菌率

各浓度PRG对MSSA、MRSA的抗菌作用在12 h内很明显，在4 h时抑菌率最高，可达52%，4 h后抑菌率逐渐下降，24 h降到最低。在12 h内，同一时间PRG1、PRG2、PRG3的抑菌率依次下降，与血小板浓度呈正相关关系，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。12 h后各组间抑菌率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，2。

3 讨论

早在1992年，MR Yeaman等就发现兔子的血小板在体外由凝血酶激活后，可以释放有广谱抗菌作用的抗菌多肽，这些多肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌病原体均有一定的抗菌性。1997年，MR Yeaman等继续对兔子血小板释放的有效体外抗菌活性多肽进行研究，发现并提纯了7种抗菌多肽，对这7种抗菌多肽进行氨基酸分析，分别表示为PMP-1，PMP-2，PMP-3，PMP-4，PMP-5，tPMP-1，tPMP-2。然而，兔子血液与人体血液成分和性质是有差别的。Tang等[10]利用人凝血酶激活正常人的血小板，以检查血小板的抗菌性并提取出7种抗菌肽：血小板因子-4(PF-4)、趋化因子(RANTES)、结缔组织活性多肽(CTAP-3)、血小板碱性蛋白、胸腺素β-4(Tβ-4)、血纤维蛋白肽B(FP-B)、血纤维蛋白肽A(FP-A)，并将提纯出来的抗菌多肽行体外抗菌活性检测。结果表明,血小板在机体感染防御中起重要作用，其可以通过局部释放抗菌多肽来抑制微生物繁殖或者杀灭微生物。

图1 各组不同时间点MSSA菌落计数(时间-抑菌曲线图) 图2 各组不同时间点MRSA菌落计数(时间-抑菌曲线图)
Fig 1 Colony count of MSSA at different time point. Fig 2 Colony count of MRSA at different time point.

表1 不同浓度PRG对MSSA的抑菌率Tab 1 Antibacterial rate of PRG with different concentrations against MSSA

表2 不同浓度PRG对MRSA的抑菌率Tab 2 Antibacterial rate of PRG with different concentrations against MRSA

本实验通过PRG体外抗菌实验进一步观察了不同浓度PRG的抗菌效果，发现PRG抗菌性随血小板浓度的增加而增加，在12 h内差异有统计学意义。PRG中主要成分血小板可以释放抗菌多肽，提示PRG的抑菌作用可能与PRG中血小板浓度有直接关系，即血小板浓度越高，激活后释放的抗菌多肽越多，抗菌性越强。这说明PRG的抗菌性有剂量依赖性。

笔者观察到PRG在体外可以抑制MSSA和MRSA生长，在2 h时最明显，随后可能由于抗菌多肽消耗，细菌开始呈对数生长，抗菌作用逐渐减弱，至12 h后未见明显抗菌作用，这表明PRG抑菌作用有时效性。Li等[11]在体外抗菌实验研究中发现，在孵育后4 h内,PRG能显著抑制MSSA、MRSA、甲类链球菌、淋球菌生长，但随后其抗菌效果逐渐降低。

笔者还发现，相同浓度的PRG在孵育2 h内，对MSSA的抗菌作用要强于对MRSA的抗菌作用，表明PRG 对不同病原微生物的抗菌作用可能是不同的。Drago等[12]采用双重连续微稀释法检测PRP对常见口腔微生物的抗菌性，结果表明PRG对粪肠球菌、白色念珠菌、无乳链球菌和口腔链球菌有抗菌性，但不能抑制铜绿假单胞菌生长。Li等[11]研究表明，PRG对E型大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌效果不明显。Bielecki等[13]发现，PRG能抑制E型大肠杆菌生长，并能促进铜绿假单胞菌生长，加速微生物感染，建议将铜绿假单胞菌感染作为PRG治疗的禁忌证。Tohidnezhad等[14]在标准纸片扩散实验研究中发现，PRP对铜绿假单胞菌(ATCC27853)有抗菌作用，但相对于大肠杆菌抗菌效果较弱。由于多次实验的菌株类型和实验方案设计的差异，对铜绿假单胞菌表现出不同的抗菌效果。由此可见，PRG在体外能抑制多种细菌生长，但对不同的病原微生物抗菌作用不同，且同一种细菌在不同的实验条件下也可能出现不同的抗菌作用，甚至可能促进某些细菌生长。

本实验结果提示,PRG体外抗菌性呈剂量依赖性，浓度越高抗菌效果越强；PRG体外抗菌性呈时间依赖性，在2 h时抗菌性最明显，随后呈下降趋势，12 h后未见明显抗菌性；PRG对不同的病原微生物抗菌作用是不同的，且同一种细菌在不同的实验条件下也可能表现出不同的抗菌作用。未来我们可以进一步研究其抗菌机制，通过生物工程推进抗菌肽的工业化生产，或将推动新型抗生素发展。

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Antibacterial activity of platelet-rich gel against Staphylococcus aureus in vitro

ZHAOLian-qian,ZHANGYu,HUIQiang,GUOBing-yu,CHANGPeng,TAOKai.

(DepartmentofPlasticSurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110084,China)

TAOKai,Email:plastypaper@163.com;CHANGPeng,Email:cp17625@163.com

Objective To explore the antibacterial effects of human platelet-rich gel (PRG) against Staphylococcus aureus in vitro,comparing the antibacterial effect at different concentrations of PRG against Staphylococcus aureus in vitro.Methods 30 ml peripheral venous from 20 healthy volunteers was prepared for platelet-rich gel with different concentrations.The platelet concentration in PRG1and PRG2and PRG3groups was 1.8×1012/L、1.2×1012/L and 0.6×1012/L,respectively.Antibiotic actions were observed after PRG at different concentrations was incubated in the MSSA (Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus),MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) solution for 1,2,4,8,12,24 hours in vitro.Results The colony count of PRG was significantly less than that of the PBS control group at 12 hours incubation.PRG had obviously antibacterial effect on MRSA and MSSA (P<0.05),the antibacterial effects of PRG were most pronounced at 2 hours; At the same time the inhibitory rate of PRG1and PRG2and PRG3groups were decreased in turn,and containing platelet concentrations were positively correlated.The differences of each colony count were statistically significant (P<0.05).After 12 hours of incubation,when the growth of bacteria had entered the stable phase,the inhibitory rate of each group was significantly decreased.There was no significant difference in the colony count (P>0.05).Conclusion In a certain period of time,PRG has a significant inhibitory effect on MSSA and MRSA,and the antibacterial activity of PRG was positively correlated with the platelet concentration.

Platelet-rich gel； Antimicrobial peptide； Antibacterial activity； Staphylococcus aureus;In vitro study

辽宁省科技厅科学技术计划项目(2013225220)

110084 辽宁 沈阳，沈阳军区总医院 整形外科

赵连前(1989-)，男，山西孝义人，硕士研究生.

陶 凯，110084，沈阳军区总医院 整形外科，电子信箱：plastypaper@163.com；常 鹏，电子信箱：cp17625@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.016

R378.1+1

A

1673-7040(2016)06-0371-04

2016-01-25)