联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜作用的体外研究

李 伟,毕 莉,李桂秋,尹晓东



实验研究

联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜作用的体外研究

李 伟,毕 莉,李桂秋,尹晓东

目的 观察连花清瘟胶囊水溶解物与头孢替唑钠联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜的体外破坏作用。方法 药物分为头孢替唑钠组、连花清瘟组、联合用药组和空白对照组；微量肉汤稀释法分别测定连花清瘟胶囊水溶解物和头孢替唑钠对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度；用酶标仪检测金黄色葡萄球菌生物膜内活菌数变化；用扫描电镜观察金黄色葡萄球菌生物膜内细菌受药物作用后的形态和大小。结果 连花清瘟组活菌数较空白对照组低(P<0.05)；头孢替唑钠组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；联合用药组活菌数低于单独用药组(P<0.05)。扫描电镜显示头孢替唑钠组生物膜中，大量细菌密集在一起,但密度较空白对照组稀疏，细菌形态基本正常，大小基本一致；连花清瘟组生物膜中形态不规则，大小不一致；而联合用药组形态更加不规则，大小更加不一致。结论 连花清瘟胶囊水溶解物对金黄色葡萄球菌生物膜具有显著破坏作用，与头孢替唑钠联合应用可起到协同增效的作用。

连花清瘟胶囊水溶解物； 头孢替唑钠； 金黄色葡萄球菌； 生物膜; 联合用药; 协同增效； 最小抑菌浓度

金黄色葡萄球菌是临床难治性感染的主要致病菌之一。对其治疗效果欠佳，其中重要的原因是金黄色葡萄球菌形成了细菌生物膜[1]，导致大多数抗生素无法突破细菌形成的生物膜而耐药。已有报道显示,连花清瘟胶囊可以突破细菌生物膜[2]，而连花清瘟胶囊和头孢替唑钠联合用药对于金黄色葡萄球菌生物膜是否具有协同增效作用的研究尚属空白。自2014年10月至2015年5月，哈尔滨医科大学附属口腔医院口腔颌面外二科观察了连花清瘟与头孢替唑钠联合用药对金黄色葡萄球菌的体外破坏作用，以期为联合用药治疗金黄色葡萄球菌感染提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

金黄色葡萄球菌ATCC25923(来源于哈尔滨医科大学附属第一医院检验科)。

1.2 药品与试剂

连花清瘟胶囊(河北以岭药业有限公司)；头孢替唑钠注射液(哈药集团制药总厂)。连花清瘟胶囊水溶解物：将连花清瘟胶囊内粉剂溶于蒸馏水，离心去除未能溶解的药物，将蒸馏水风干便得到连花清瘟胶囊水溶解物。

1.3 主要仪器

酶标仪(美国美谷分子公司),扫描电子显微镜(日立公司)。

1.4 方法

1.4.1 测定最小抑菌浓度 通过微量肉汤稀释法分别测定连花清瘟胶囊水溶解物与头孢替唑钠对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度[3]。

1.4.2 实验分组 将各药物溶解于含0.5%葡萄糖的LB液体培养基，使配成的各药液浓度均为最小抑菌浓度，分为4组：头孢替唑钠组、连花清瘟组、联合用药组和空白对照组。空白对照组为含0.5%葡萄糖的LB液体培养基，不含药物。

1.4.3 建立金黄色葡萄球菌生物膜模型 用含0.5%葡萄糖的LB液体培养基调整金黄色葡萄球菌菌液吸光度A600为0.05，接种于96孔板，200 μl/孔；接种于24孔板，500 μl/孔，37℃培养24 h，形成生物膜。其中24孔板底部放有经灭菌的15 mm×15 mm玻片爬片[4]。

1.4.4 酶标仪检测金黄色葡萄球菌生物膜内活菌数变化 吸取96孔细胞培养板中的菌液，按实验分组加入药液200 μL,空白对照组加入等量培养基，37℃培养24 h，PBS小心冲洗,去除各组药液和空白对照组的培养基。各组加入5 g/L MTT，20 μl/孔避光孵育4 h后吸除未与生物膜结合的MTT；加入150 μl DMSO溶液，摇床震荡10 min，使结晶充分溶解。利用酶标仪检测A490吸光值；重复3次实验,取平均值[5]。

1.4.5 扫描电镜观察金黄色葡萄球菌生物膜 吸取24孔板中成熟金黄色葡萄球菌生物膜上清，洗去悬浮细菌，按实验分组加入药液，空白对照组内加入培养基，体积均为500 μl。37℃培养24 h，样本用PBS溶液清洗2次，洗掉悬浮细菌，2.5%戊二醛固定，乙醇逐级脱水，真空冷冻干燥，喷金，利用扫描电子显微镜拍照，观察金黄色葡萄球菌生物膜内细菌受药物作用后的形态和大小。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 最小抑菌浓度

头孢替唑钠和连花清瘟胶囊水溶解物对金黄色葡萄球菌ATCC25923的最小抑菌浓度分别为0.12 μg/ml和5 mg/ml。

2.2 金黄色葡萄球菌生物膜内活菌数

酶标仪检测的各组A490吸光值分别为3.267±0.030(头孢替唑钠组)、2.953±0.025(连花清瘟组)、2.318±0.103(联合用药组)和3.300±0(空白对照组)；头孢替唑钠组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，连花清瘟组较空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，联合组较各组差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 扫描电镜观察结果

空白对照组大量细菌密集叠加在一起，形态正常，大小基本一致；头孢替唑钠组大量细菌密集叠加在一起，密度较空白对照组稍稀疏，形态基本正常，大小基本一致；连花清瘟组可见菌落散在，形态不规则，大小不一致；联合用药组较连花清瘟组的菌落更散在，密度更加稀疏，大小更加不一致。见图1。

图1 各组扫描电镜图片(×6500) a.空白对照组 b.连花清瘟组 c.头孢替唑钠组 d.联合用药组
Fig 1 Pictures of each group (SEM×6500). a.control group. b.water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group. c.Ceftezole Sodium group. d.drug combination group.

3 讨论

因不当的美容注射导致的感染是一个棘手问题，尽管临床上积极采用切开引流、换药及使用抗生素等措施，但有时长期感染仍难以愈合。脓汁细菌培养发现，金黄色葡萄球菌是主要致病菌之一，长期感染治疗效果不佳的主要原因是细菌耐药，金黄色葡萄球菌形成生物膜、产生β-内酰胺酶以及抗生素作用靶点的改变，是其产生耐药的原因[6]。有报道中成药连花清瘟胶囊可突破细菌生物膜，故先用中药破坏生物膜，然后利用抗生素进入细菌杀菌，为临床寻求新的治疗方法提供了一定的基础[7]。

连花清瘟胶囊由连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、石膏、薄荷脑、红景天、甘草组成，具有清瘟解毒，宣肺泄热的作用[8-11]。本研究表明，连花清瘟胶囊水溶解物和头孢替唑钠的联合应用较单一应用抑菌作用更强(P<0.05)，联合用药组细菌密度较空白对照组明显稀疏且大小更加不一，提示连花清瘟胶囊水溶解物和头孢替唑钠合用能起到协同增效作用。其抑菌机制可能是,连花清瘟胶囊水溶解物破坏细菌生物膜后，头孢替唑钠可以对生物膜破坏后的细菌起杀灭作用[12]。此结果为临床上是否可以制作连花清瘟胶囊水溶解物，对此类感染创口进行局部冲洗和静脉注射抗生素联合用药，以加速感染创口的愈合，提供了一定的研究基础。

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Effect of drug combination on the biofilm of Staphylococcus aureus in vitro

LIWei,BILi,LIGui-qiu,YINXiao-dong.

(TheSecondDepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatologyAffliatedtoHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

YINXiao-dong,Email:yinxiaodong117@126.com

Objective To observe the destructive effect in vitro of water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule combined with Ceftezole Sodium on Staphylococcus aureus biofilm.Methods The drugs were divided into Ceftezole Sodium group,water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group,drug combination group and control group.The minimal inhibitory concentration of water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule and Ceftezole Sodium against Staphylococcus aureus was detected by a broth microdilution methed.Staphylococcus aureus biofilm was built and a microplate reader was used to evaluate changes in the number of living bacteria.Scanning electron microscopy (SEM) was used to observe the morphology and thickness of bacteria in Staphylococcus aureus biofilm.Results The number of living bacteria in water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group was decreased compared with the control group (P<0.05),while it was not significant in Ceftezole Sodium group (P>0.05).The number of living bacteria in the drug combination group was decreased compared with either drug alone group (P<0.05).The results of SEM showed Staphylococcus aureus biofilm in Ceftezole Sodium group with a large number of bacteria close together,but the density was a little thin compared with the control group,an almost normal bacterial form,and basically the same size.Staphylococcus aureus biofilm in water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group showed bacteria was irregular form,different size.Staphylococcus aureus biofilm in drug combination group showed bacteria was more inconsistent form,the more inconsistent size.Conclusion Water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule has a significant destructive effect on Staphylococcus aureus biofilm in vitro.There was a synergetic destructive effect on Staphylococcus aureus biofilm in combination with Ceftezole Sodium.

Water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule; Ceftezole Sodium; Staphylococcus aureus; Biofilm; Drug combination; Synergetic destructive effect; Minimal inhibitory concentration

黑龙江省中医药、中西医结合重点科研项目(060032)

150001 黑龙江 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属口腔医学院 口腔颌面外科二病房(李 伟,尹晓东)；哈尔滨医科大学附属第一临床医学院 检验科(毕 莉,李桂秋)

李 伟(1989-)，男，河南人，医师，硕士研究生.

尹晓东，150001，哈尔滨医科大学附属口腔医学院 口腔颌面外科二病房，电子信箱：yinxiaodong117@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.015

R378.1+1

A

1673-7040(2016)06-0368-03

2016-01-25)