p-STAT3蛋白在增生性瘢痕中的表达及意义

李 允，田社民，查新建，魏 莹，黄红军，肖宏涛，赵孝开



实验研究

p-STAT3蛋白在增生性瘢痕中的表达及意义

李 允，田社民，查新建，魏 莹，黄红军，肖宏涛，赵孝开

目的 检测JAK2/STAT3信号通路中STAT3蛋白在人增生性瘢痕中的表达，探讨其在增生性瘢痕中的作用及意义。方法 采用免疫组织化学方法和Western blot检测方法分别检测32例增生性瘢痕和22例正常皮肤组织中p-STAT3的表达情况。结果 ⑴免疫组织化学检测显示,p-STAT3蛋白在增生性瘢痕及正常皮肤组织中均有表达，染色阳性物质主要位于细胞质，少部分位于细胞核，在表皮和真皮层均有表达，在增生性瘢痕组织中表达量均高于正常皮肤组织，差异具有统计学意义(P=0)；⑵Western blot检测结果显示，增生性瘢痕中p-STAT3蛋白的表达均较正常皮肤高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 增生性瘢痕中p-STAT3呈现高表达，提示JAK2/STAT3信号通路异常激活可能在增生性瘢痕发生过程中起重要作用。

增生性瘢痕； JAK2/STAT3信号通路； p-STAT3

增生性瘢痕是皮肤组织烧创伤后,以胶原过度沉积、血管增生为特征的皮肤纤维化疾病。JAK2/STAT3是一条较新且最近研究最多的通路之一，其参与机体多种组织器官的细胞增殖、纤维化、免疫功能改变等过程[1-2]。相关研究已经证明，JAK2/STAT3 通路与多种组织器官纤维化的关系密切[3]。目前，JAK2/STAT3信号通路在增生性瘢痕中的作用尚未报道。自2013年3月至2015年2月，郑州市第一人民医院烧伤科以增生性瘢痕为研究对象,探讨JAK2/STAT3信号通路在增生性瘢痕中的作用。

1 对象与方法

1.1 主要试剂 Western blot 化学发光检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；p-STAT3 单克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)；免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂(福建迈新生物公司)。

1.2 标本来源 增生性瘢痕入院行整形手术的患者32例，男性17例,女性15例;年龄1～42岁。术前均未行其他治疗，不伴有溃疡等病变，均为增生期瘢痕。 取材部位：上肢14例,躯干4例，面颈部6例,下肢8例。正常皮肤22例，为患者手术时取皮修剪后的残余皮片。所有患者均签署知情同意书；且本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.3 标本采集及处理 标本取材后，分为2份，1份标本经固定，脱水,透明，包埋后制成石蜡块，行3 μm切片用于免疫组化染色。另外1份保存于液氮，用于Western blot检测。

1.4 标本的免疫组织化学染色 免疫组织化学法检测参照试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡、水化及抗原修复后,PBS冲洗3次,3 min/次,1%BSA室温封闭20 min，加一抗，4℃冰箱过夜(p-STAT3抗体稀释浓度为1∶200)，二抗室温下孵育20 min，滴加DAB，苏木素复染3 min,流水稍冲洗，盐酸乙醇分化，梯度脱水透明，中性树胶封片，PBS代替一抗做阴性对照，光学显微镜下观察染色结果，高倍光学显微镜下取5个观察视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算各抗体蛋白面密度(阳性颗粒的总面积及光密度值，然后计算出单位面积的面密度值)[4]。

1.5 Western blot检测p-STAT3蛋白的表达 常规提取组织蛋白，测定其浓度，各组加入20 μg蛋白样本，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5 min，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，400 mA电流转膜120 min，5%牛血清白蛋白封闭2 h，1×TBST洗涤3次，10 min/次，加入一抗，4℃孵育过夜，二抗孵育1 h，1×TBST充分漂洗后用ECL试剂盒显色。所有内参对照均使用小鼠抗GAPDH(稀释度为1∶5000)。所得图像均用image lab软件扫描作灰度分析 (目的蛋白/GAPDH的比值)。

2 结果

2.1 p-STAT3的免疫组织化学检测结果 p-STAT3在增生性瘢痕组织 (图1a)及正常皮肤组织 (图1b) 中均有表达；光学显微镜下p-STAT3染色阳性物质主要位于细胞浆，少部分位于胞核，为均匀棕黄色颗粒；在表皮细胞、真皮层成纤维细胞及血管内皮细胞中均有表达；在增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中的蛋白表达量分别是0.29±0.01和0.15±0.03，差异具有统计学意义(t=22.6，P<0.05)。

2.2 Western blot检测结果 p-STAT3蛋白在增生性瘢痕及正常皮肤均有表达(图2)，表达量分别为0.58±0.13和0.32±0.05，差异具有统计学意义(t=2.86，P<0.05)。

3 讨论

增生性瘢痕是皮肤创伤后一种病理性的愈合结果，可出现瘙痒、疼痛、外观改变，严重影响患者的日常生活和工作，目前康复期瘢痕增生的治疗仍然比较棘手，增生性瘢痕形成机制的研究尚未获得突破性的进展，因此，有必要进行进一步的研究[5-6]。

图1 免疫组化检测结果(SP ×200) a.增生性瘢痕 b.正常皮肤 图2 Western blot检测结果
Fig 1 Results of IHC (SP ×200). a.the hypertrophic scar.b.the normal skins. Fig 2 Results of Western blot.

Janus 激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)是一条由多种细胞因子和生长因子共同介导的信号通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等病理生理过程[7-9]。该信号通路主要由酪氨酸激酶相关受体、JAK 和STAT 组成[10]。研究显示，JAK/STAT 信号通路在体内不同组织及器官的纤维化进程中发挥重要的调控作用[11]。Pang等在小鼠肾间质纤维化模型研究中发现，JAK2/STAT3 信号通路激活可增加肾脏的炎症细胞和纤维胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达，并介导了肾间质成纤维细胞的激活，加速肾纤维化进展[12]。Nieto[13]研究发现，JAK2/STAT3 信号通路的异常激活可促使肝脏中Kupffer细胞分泌大量的IL-6，导致肝星状细胞纤维化，而使用特异性抑制剂AG490 抑制该通路可以明显抑制肝纤维化。在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，抑制JAK/STAT3通路活性可减轻和抑制小鼠肝脏纤维化的形成[14]。国外学者在研究中发现，肺纤维化组织中存在着 JAK、STAT1 和 STAT3 的过度表达[15]。因此,JAK2 /STAT3 信号通路与组织器官的纤维化病理改变密切相关。

增生性瘢痕也是一种组织纤维化疾病，以成纤维细胞大量增殖、血管大量生成及胶原异常沉积为特征[5]。本研究中免疫组化和Western blot检测结果均显示，在增生性瘢痕中，STAT3蛋白的表达均比正常皮肤中高，且差异均具有统计学意义，提示STAT3与增生性瘢痕的形成存在一定的关联，JAK2/STAT3信号通路的异常激活可能参与了增生性瘢痕的形成和发展，特异性阻断JAK2/STAT3信号通路是否会达到抑制瘢痕增生的效果？我们下一步将在体内和体外实验中进一步研究该通路在增生性瘢痕发生中的作用，研究其具体作用机制，以期为增生性瘢痕的早期治疗提供新的思路和靶点。

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Expression of STAT3 protein in hypertrophic scar and its significance

LIYun,TIANShe-min,ZHAXin-jian,WEIYing,HUANGHong-jun,XIAOHong-tao,ZHAOXiao-kai.

(DepartmentofBurnsandOrthopedics,ZhengzhouFirstPeople′sHospital,Zhengzhou450000,China)

Objective To investigate the expression of STAT3 protein of JAK2/STAT3 pathway in hypertrophic scars and its significance.Methods The expression of p-STAT3 in 32 cases of hypertrophic scar and 22 cases of normal skin were detected by immunohistochemistry (IHC) and Western blot.Results ⑴ IHC showed that p-STAT3 protein was expressed in both hypertrophic scar and normal skin.Normal skin tissue staining substances are mainly located in the cytoplasm,with a small part in the nucleus.The level of p-STAT3 protein in hypertrophic scars was higher than that in the normal skin,the difference had a statistical significance (P=0)； ⑵ Western blot showed that the expression of p-STAT3 in the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that in the normal human skins; the difference had a statistical significance (P<0.05).Conclusion The strong expressions of p-STAT3 in hypertrophic scars indicated that the abnormal activity of the JAK2/STAT3 pathway may play an important role in the occurrence of the hypertrophic scar.

Hypertrophic scar; JAK2/STAT3 pathway; p-STAT3

450000 河南 郑州，郑州市第一人民医院 烧伤科

李 允(1979-)，男，河南郑州人，主治医师.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.017

R619.6

A

1673-7040(2016)06-0375-03

2016-01-21)