腺病毒介导IL-24基因对瘢痕疙瘩表达PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的影响

沈 剑， 史玉仓， 吴志贤， 莫自增， 申福定， 梁 杰



腺病毒介导IL-24基因对瘢痕疙瘩表达PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的影响

沈 剑， 史玉仓， 吴志贤， 莫自增， 申福定， 梁 杰

目的 探讨腺病毒介导白细胞介素-24基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞中纤溶酶原激活物抑制剂-1和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA及蛋白水平表达的影响。方法 构建白细胞介素-24腺病毒载体，感染瘢痕疙瘩成纤维细胞，并设置阴性对照组和空白对照组。应用实时定量PCR检测纤溶酶原激活物抑制剂-1及Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白mRNA表达的变化，Western Blot检测纤溶酶原激活物抑制剂-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白水平表达的变化。结果 白细胞介素-24腺病毒载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后，与阴性对照组相比，感染组纤溶酶原激活物抑制剂-1和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA及蛋白表达量降低(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 白细胞介素-24腺病毒载体可能通过调节纤溶酶原激活物抑制剂-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达，减少瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原等细胞外基质的沉积。

白细胞介素-24基因； 瘢痕疙瘩； 纤溶酶原激活物抑制剂-1； Ⅰ型胶原蛋白； Ⅲ型胶原蛋白

白细胞介素24(interleukin-24, IL-24)基因是定位于1号染色体的1q32.2-1q41位点的一个单拷贝基因，有7个外显子和6个内含子，由7025个pb组成[1]，能选择性地抑制肿瘤细胞的生物活性，且不影响正常细胞[2]。Liang等[3]发现，与正常皮肤成纤维细胞相比，IL-24在瘢痕疙瘩成纤维细胞中呈低表达或不表达状态。提示IL-24可能参与了瘢痕疙瘩的形成，并通过IL-24腺病毒载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞，结果显示IL-24腺病毒载体能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，但IL-24基因能否抑制细胞外基质的过度沉积尚不清楚。自2014年1月至2015年9月，广东医学院附属医院整形外科采用体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts, KF)，并用已构建好的IL-24腺病毒载体感染目的细胞，应用实时定量PCR和Western blot检测纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA及蛋白表达的变化。

1 标本来源

瘢痕疙瘩标本取自广东医学院附属医院门诊及住院手术患者15例。男性6例，女性9例；年龄15～39岁。所有患者均排除了其他器质性疾病，在手术切除前未接受其他任何治疗。经临床及病理诊断后，均获患者知情同意。

2 实验材料

DMEM低糖培养基、10g/L牛血清白蛋白BSA、胰酶、双抗(链霉素-青霉素)、TRIZOL (美国GIBCO公司)； Real-time PCR 试剂盒(日本同仁化学公司)；反转录试剂盒(美国PROMEGA公司)；洁净工作台(苏净安泰公司)；BCA试剂盒(上海碧云天公司)，PAI-1、COL Ⅰ、COL Ⅲ抗体(英国ABCAM公司)；含重组IL-24腺病毒载体的293A细胞由本课题组前期实验构建保存。

3 实验方法

3.1 重组腺病毒载体的纯化及病毒滴度测定 取冻存的含重组腺病毒载体(Ad-IL-24)的293A细胞复苏，以含10%胎牛血清DMEM培养基，置于37℃、5%CO2孵箱中培养24 h。采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化。将生长良好的293A细胞，经0.5%胰酶消化后于显微镜下计数，用含10%胎牛血清DMEM培养基稀释至细胞终浓度为1×104/ml，按100 μl/孔接种至96孔板中，培养24 h。采用逐孔稀释法测定腺病毒滴度。

3.2 细胞培养和实验分组 将切取的瘢痕疙瘩标本剪去表皮和皮下组织，切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm～1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的组织块，在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml 的DMEM培养液，37℃、5%CO2，饱和湿度下，以组织贴壁法进行原代培养。选择3～5代对数生长期细胞进行实验，将细胞分为3组。AD-IL-24组(感染AD- IL-24-GFP腺病毒的细胞)，KF-NC组(阴性对照组即感染AD-GFP腺病毒的细胞)，KF-CON组(空白对照组即未感染腺病毒的细胞)。

3.3 腺病毒转染及效率的测定 将100 μl含病毒液的无血清培养液加入KF中，腺病毒以感染复数为10感染KF，在37℃，5%CO2条件下培养2 h，置于含15%胎牛血清培养液中继续培养。流式细胞仪计算感染效率。

3.4 引物设计与合成 检索NCBI GenBank数据库,应用Primer premier 5.0设计出PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白基因以及内参β-actin基因的上下游引物序列(表1)，由上海生工合成。3.5 实时定量PCR检测PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达 弃培养液，PBS洗涤3遍，每孔加入200 μl Trizol,按照常规方法用氯仿和异丙醇提取KF的总RNA,M-MLV反转录酶逆转录成cDNA,实时定量PCR检测PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达。采用相对定量2-△△Ct法比较基因的表达差异。设定空白对照组目的基因mRNA的表达量为1。

△Ct值=目的基因组Ct值-β-actin组Ct值

△△Ct值=实验组△Ct值-对照组△Ct值

表1 PCR的引物序列和产物的预期长度

3.6 Western Blot检测PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达 抽提KF总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白后电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶TBST溶液封闭，分别按推荐稀释比例加入相应的一抗，4℃摇床上过夜，次日洗膜3次，再分别加入相应的二抗，ECL法显色后化学发光成像仪上显影，并保存图像。

3.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学处理，组间比较采用q检验及方差分析，检验水准α=0.05。

4 结果

4.1 瘢痕疙瘩组织标本病理学诊断 对标本行病理切片检测，结果显示，镜下均见粗大稠密的胶原纤维和大量包裹在一起的未成熟原纤维(图1)。

4.2 腺病毒载体滴度测定 含Ad-IL-24的293A细胞复苏培养24 h后，可在荧光显微镜下观察到已表达的绿色荧光蛋白(图2)，采用氯化铯密度梯度离心法纯化，继续培养，以GFP阳性计数法测得重组腺病毒Ad-IL-24滴度为102pfu/ml。

4.3 重组腺病毒的感染效率 腺病毒以感染复数为10感染KF细胞96 h后，流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白细胞的比例，结果IL-24腺病毒载体感染KF达到80%以上，符合基因治疗对载体的要求。

4.4 PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达 腺病毒以感染复数为10感染KF 96 h后，实时定量PCR检测实验各组PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达情况，β-actin为内参。KF-IL-24组细胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达量明显下降，与KF-NC组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；KF-NC组与KF-CON组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

4.5PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白蛋白水平表达 腺病毒以感染复数为10感染KF96h后，Westernblot检测实验各组PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白水平表达情况，β-actin为内参。KF-IL-24组细胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白蛋白表达量较KF-NC组明显下降(P<0.05)，KF-NC组与KF-CON组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图4。

5 讨论

病理性瘫痕分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩是组织创伤后的异常修复[4]，组织学上表现为以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，以及以Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白为主的细胞外基质沉积，真皮组织过度增生[5]。Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白主要由成纤维细胞合成，是细胞外基质中最活跃的成分之一，是瘢痕形成的关键因素。范东良等[6]发现，氧化苦参碱作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞时，能够明显抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA及蛋白水平的表达，从而抑制瘢痕疙瘩生长。Lin等[7]研究表明，Ⅰ型胶原蛋白在瘢痕疙瘩的表达量明显高于正常皮肤，并随着瘢痕疙瘩的生长不断增加，Ⅲ型胶原蛋白在瘢痕疙瘩生长初期的表达量明显增高，而在后期有所下降，主要分布在组织外周及靠近基底部。因此，在瘢痕疙瘩组织中粗大僵硬的Ⅰ型胶原比例增加，Ⅲ型胶原纤维(网状纤维)的相对减少和分布的改变，使皮肤的正常结构遭到严重破坏，因而瘢痕疙瘩既保存了增生性瘢痕的性质又有其独特的性质，即侵袭性及复发性。提示改变瘢痕疙瘩中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量和比例，有可能达到治疗目的。

图1 瘢痕疙瘩组织病理切片(HE染色) a.×10 b.×400 图2 复苏24 h后表达绿色荧光蛋白的293A细胞(×40) 图3 IL-24腺病毒载体对KF细胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达的影响(注：*表示与阴性对照组相比，P<0.05) 图4IL-24腺病毒载体对KF细胞PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

Fig 1 Pathological slices of keloid tissue (HE). a.×10. b.×400. Fig 2 Expression of 293A cells with green fluorescent protein at 24 h after recovery (×40). Fig 3 Effect of IL-24 cells adenovirus vector on expression of PAI-1 and type I and Ⅲ collagen mRNA.Fig 4 Effect of IL-24 cells adenovirus vector on expression of PAI-1 and type I and Ⅲ collagen protein.

纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1， PAl-1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一员，是最主要的纤溶酶源激活物抑制剂。研究表明，PAI-1在多种组织的纤维化过程中起着主要作用[8]，在培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞内，其主要通过灭活尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及组织型纤溶酶原激活物(tPA)，促进ECM沉积而参与瘢痕疙瘩的形成。通过沉默技术降低PAl-1在瘢痕疙瘩细胞中表达可以抑制细胞增殖及瘢痕疙瘩组织生长[9]。

IL-24基因在肿瘤基因治疗方面的研究比较多，具有广泛的抗肿瘤作用。研究表明,通过在神经母细胞瘤[10-11]、黑色素瘤[12]等多种肿瘤细胞内过表达IL-24水平均可以起到抗肿瘤作用。其作用主要是通过抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成及肿瘤细胞转移而实现的[13]。我们前期实验通过对IL-24病毒载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞的观察发现,IL-24可抑制细胞的增殖，促进凋亡[14]。但其对细胞外基质过度沉积的作用尚不清楚，因此,我们用IL-24腺病毒载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞，探讨IL-24腺病毒载体对PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响。实时定量PCR及Western blot结果显示,IL-24腺病毒载体可抑制PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA和蛋白水平的表达，PAI-1基因的抑制，可使uPA及tPA活性增强，从而避免ECM过度沉积。Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白mRNA和蛋白的表达均受到抑制，但Ⅰ型胶原蛋白的表达抑制更加明显，与邢帮荣等[15]的实验结果有相似之处，表明IL-24可以抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的产生，改善Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例失衡，从而抑制瘢痕疙瘩的生长发展。瘢痕疙瘩的形成过程中,不但细胞外基质过度沉积，而且还受到缺氧环境等复杂微环境的影响，因此，其与缺氧环境及其他细胞因子之间的相互作用还待进一步研究阐明。

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Effects of adenovirus mediated interleukin-24 gene on the expression of PAI-1, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen of keloids

SHENJian,SHIYu-cang,WUZhi-xian,MOZi-zeng,SHENFu-ding,LIANGJie.

(DepartmentofPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

LIANGJie,Email:liangjieplastic@163.com

Objective To investigate the effect of IL-24 gene on expression on mRNA and protein level of Plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1), type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen of human keloid fibroblasts (KFs). Methods Interleukin 24 (IL-24) gene was cloned into adenovirus vector, then the adenovirus particles expressing IL-24 were infected into keloid fibroblasts (KF cells), KF-IL-24; KF-NC and KF-CON were used as the control groups. Real time PCR and Western blot were performed to examine the expression of IL-24 in adenovirus infected cells. Results Compared with KF-CON group and KF-NC group, the expression levels of IL-24 mRNA and protein were both significantly upregulated in KF-IL-24 group after KF cells were infected (P>0.05).ThedifferencebetweentheKF-CONgroupandKF-NCgroupwasnotstatisticallysignificant(P>0.05). Conclusion Adenovirus-mediated IL-24 gene may inhibit deposition of extracellular matrix of KF through controlling the expressions of PAI-1, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen mRNA and protein.

Interleukin-24 gene; Keloid; Plasminogen activator inhibitor-1; Type Ⅰ collagen; Type Ⅲ collagen

广东省省级科技计划项目(2013B021800063) 作者单位：524001 广东 湛江，广东医学院附属医院 整形外科 第一作者：沈 剑(1989-)，男，河南信阳人，硕士研究生. 通信作者：梁 杰，524001，广东医学院附属医院 整形外科，电子信箱：liangjieplastic@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.03.019

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A

1673-7040(2016)03-0177-04

2016-01-10)