植物免疫系统研究进展

夏启中

(黄冈师范学院 生物与农业资源学院，湖北 黄冈 438000)

不同的病原物采用不同的策略侵染植物。病原细菌通过气孔或排水孔，或通过伤口进入后，在胞间质外体中繁殖。线虫和蚜虫可直接插入口器进入植物细胞而获得喂饲。真菌也可直接进入植物表皮细胞，或延伸其菌丝进入植物细胞表面、细胞间和胞质中。病原真菌和卵生菌能内折吸盘进入寄主的细胞膜。吸盘的胞膜、胞外基质和寄主胞膜形成一个紧密的界面，在界面结合处产生相互作用。各种类型的病原菌都能将其激活物(效应分子、毒性分子)导入植物细胞，从而增强病原菌的感染性。

植物不像动物，没有可移动的防卫细胞和体细胞适应性免疫系统,只能依赖于每个细胞的内在免疫性和从感染位点产生的系统信号[1-2]。植物抗病蛋白(R)具有多样性，根据“看护假说”，R蛋白可能被病原菌编码的激活物间接激活，而不是被直接识别。这意味着R蛋白通过监控激活物作用的寄主细胞目标的完整性而间接识别病原菌激活物。R蛋白识别“病原菌诱导的自我修饰”与哺乳动物免疫系统中的“危险信号”模型中的“自我修饰”的识别相类似[3]。

植物具有两种类型的植物免疫系统。一类是通过跨膜模式识别受体(PRRs)对缓慢进化的微生物或病原菌相关联的分子模式(MAMPs或PAMPs)，例如鞭毛蛋白产生反应；第二类利用由多数R基因编码的多态性NB-LRR蛋白产物在细胞内起作用。NB-LRR与动物CATEPILLER/NOD/NLR蛋白和STAND ATPase相关联[4]。多种多样的病原菌激活物被NB-LRR蛋白识别，激活防卫反应。NB-LRR介导的抗病性对专化性活体营养型或半活体营养型是有效的，但对侵染期间杀死寄主组织的病原菌(死体营养型)则不起作用[5]。

对植物免疫反应的代表性观点可概括为“四阶段的锯齿状”模型。在第一阶段，PAMPs(或MAMPs)被PRRs识别，导致PAMPs启动的免疫性PTI，阻止进一步侵染；在第二阶段，成功侵染的病原菌产生具毒性的激活物，激活物能干扰PTI，导致激活物启动的感病性(ETS)；在第三阶段，激活物特异性地被特定NB-LRR蛋白识别，导致激活物启动的免疫性(ETI)产生。对激活物的识别可以是间接的，也可以是通过NB-LRR直接的。ETI是一种加速和放大的PTI效应，可产生抗病性。在第四阶段，自然选择使病原菌通过摆脱或通过其他的激活物来抑制ETI，从而逃避了ETI。自然选择导致新的特异性R产生以重启ETI[6]。

1 微生物和植物识别模式

植物基础抗病性是由毒性病原菌对感病寄主所激活的抗病性。有人认为基础抗性是“PTI加上弱ETI减去ETS，即PTI+弱ETI-ETS”。对PTI典型的激发子是细菌鞭毛蛋白，可以启动不同植物的防卫反应。基于运动性的鞭毛蛋白对细菌在植物中的致病性非常重要。一种合成22个氨基酸多肽flg22，来源于保守的鞭毛蛋白结构域，足以诱导包括至少1100个拟南芥基因快速转录在内的许多胞内防卫反应。利用flg22进行遗传筛选，拟南芥LRR受体激酶FLS2可以结合flg22[7]。FLS2和哺乳动物TIR5可识别不同鞭毛蛋白结构域。FLS2被受体介导的内吞过程转化为后续的刺激，该内吞过程可能具有调控功能[8]。FLS2突变体对致病的Pseudomonassyringaepv.tomato DC3000(Pto DC3000)的喷施表现出增强的敏感性，但对P.syringae的渗透进入叶片质外体则未出现类似现象[9]，这暗示FLS2在早期抵抗病原菌入侵中发挥了作用。

细菌的冷休克蛋白和延伸因子Tu(EF-Tu)可激活类似的对flg22的防卫反应。EF-Tu被称为EFR的一种拟南芥LRR激酶识别。EFR突变体有利于较高水平的农杆菌(Agrobacterium)的瞬时转化，说明PTI可能限制了农杆菌的致病性。用保守的EF-Tu多肽处理可以诱导与flg22诱导几乎一样的基因系列的表达。相反，EFR的转录被flg22诱导[10]。因此，对MAMPs/PAMPs的反应集中在限定的信号途径上，且导致了常规信号系列输出，从而抑制PTI。很显然，NB-LRR功能所必需的基因突变对flg22的早期反应没有影响[10]。因此，NB-LR依赖的信号与MAMPs/PAMPs介导的信号涉及到不同的组分。

由微生物表达的诱导PTI的分子不容易被微生物所丢弃。来自不同的野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)的鞭毛蛋白对启动拟南芥FLS2介导的PTI一直有效，而来自农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或来自中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的鞭毛蛋白比来自P.syringae的启动活性更弱一些。来自PtoDC3000比来自农杆菌(Agrobacterium)的EF-Tu在激发PTI的活性要弱很多[6]。在一些植物品种中PAMP反应也存在一些的变化。拟南芥Ws-O带有一个FLS2的点突变，它对flg22没有反应[7]。事实上，单个植物品种只识别一小类潜在的PAMPs。无论是PAMPs还是PRRs都不是固定不变的，都要受制于自然选择。

由于农杆菌抽提物能激发FLS2和EFR-1双突变体，因此必然存在另一种MAMPs/PAMPs和相对应的PRRs[10]。其它的LRR激酶可能编码另一种PRRs，该PRRs的转录被相关PRRs所刺激。在拟南芥Col-0基因组中，有超过200个LRR激酶存在，其中28种在flg22处理后30分钟内被诱导。FLS2和EFR是具有某种特异功能的非典型植物免疫系统的激酶家族成员。还有56种拟南芥受体类蛋白(RLPs)，它们可以编码Ⅰ型具有LRR胞外结构域的跨膜结构域，但不含胞内激酶结构域[11]。MAMP/PAMP激发可能通过增强对其它微生物模式的反应来进一步引发防卫反应[7]。

2 病原菌抑制PTI

一些激活物可能作为结构组分，例如，在真菌和卵生菌感染时外吸盘形成过程中,另一些激活物可以启动营养渗漏或病原菌分散。许多激活物可能起抑制PTI或ETI的作用。PTI和ETI参与不同机制到何种程度仍未可知，并且有些激活物作用的目标是ETI而不是PTI，反之亦然[6]。

植物病原细菌采用 III型分泌系统 (TTSS)可以向寄主细胞转运15～30个激活物。细菌激活物产生病原菌毒素通常是通过模拟或抑制真核生物细胞功能[12]。一个病原假单胞菌(P.syringae)菌株的TTSS发生了突变，不能运转III型激活物，但却比等位的野生型菌株可启动大豆中更快更强烈的转录编程。这种菌株代表了所有细菌MAMPs/PAMPs可诱导与flg22实质上相同的基因的转录[13-14]。因此，来自成功细菌病原菌的III型激活物能降低PTI，以允许细菌侵入[15]。

ARF-GEF蛋白可能参与了寄主细胞的囊泡运输，假单胞菌(P.syringae)HopM激活物作用于至少一种ARF-GEF蛋白。HopM与不相关联的AvrE激活物一起在P.syringae毒性中发挥作用[16]，这意味着对寄主囊泡运输的控制对细菌成功侵染十分重要。AvrPto 和AvrPtoB是不相关联的两种III型激活物，可以通过抑制PTI早期步骤，MAPKKK上游而对其毒性产生作用[17]。同其它III型激活物一样，AvrPtoB是一个两组分蛋白，其氨基端对毒性起作用，其羧基端可能对阻断寄主细胞死亡起作用[18]。来自于AvrPtoB的C末端的一个结构域折叠成一个具有活性的E3连接酶，其功能可能涉及到寄主蛋白的降解[19]。鼠疫杆菌(Yersinia)激活物YopJ，是一个来自于植物病原细菌的激活物Avr Rxv家族的成员，可通过乙酰化MEK蛋白上磷酸化调控残基而抑制MAP激酶级联反应[20]。许多其它的细菌III型激活物蛋白家族已被鉴定出来[12]；其作用目标和功能还有待阐明。

真菌和卵生菌激活物既能作用于胞外基质，又能作用于寄主细胞内。例如，西红柿RLPs, Cf-2, Cf-4, Cf-5 和 Cf-9对由黄枝包霉菌(Cladosporiumfulvum)产生的胞外激活物产生特异性的反应[21]。其它真菌和卵生菌可能在寄主细胞内起作用；它们被NB-LRR蛋白所识别。例如，来自霜霉菌(Hyaloperonosporaparasitica)编码卵生菌激活物Atr13的基因在不同菌株间表现出极强的等位基因多样性，与之相匹配的是拟南芥对应的RPP13 NB-LRR座位的多样性。在霜霉菌(H.parasitica)Atr1和拟南芥RPP1等位基因之间的多样性也可观察到[22]。Atr1和Atr13常带有从霜霉菌(H.parasitica)分泌用的信号肽。它们彼此共享，且与马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)Avr3a蛋白具有共同保守序列，是一个能使疟原虫激活物进入哺乳动物寄主细胞的RxLR模体[23]。这与卵生菌与疟原虫(Plasmodium)分类学上相近时一致的。亚麻锈菌(Melampsoralini)种群表达Avr基因，可以被亚麻特异性的 L, M 和 P NB-LRR蛋白特异性的等位基因所识别。这些吸盘蛋白质带有利于真菌输出的信号肽，能在植物细胞内发挥作用[24]。但是大麦白粉病(Blumeriagraminisf.sp.hordei)Avrk 和 Avra10蛋白被NB-LRR大麦基因Mlk和Mla10识别，两种蛋白既不包含信号肽，也没有RxLR模体，是Blumeria和Erysiphe品系中的大基因家族的成员[6]。这些卵生菌和真菌激活物如何被转运到寄主细胞，如何对病原菌毒性起作用还未可知。

病原菌产生小分子激活物，模拟植物激素。一些假单胞菌(P.syringae)菌株产生冠状毒素，一个茉莉酸模拟物而抑制茉莉酸介导的对活体营养病原菌产生防卫反应，诱导气孔开放，帮助病原菌获得进入质外体通道。PTI涉及生长素反应的抑制，部分受小RNA介导，小RNA也在脱落酸介导的胁迫反应中被诱导[25]。赤霉素在病原真菌赤霉菌(Gibberellafujikuroi)诱导下产生，导致赤霉病症状。细胞分裂素由许多病原菌诱导产生，能促进病原菌延缓感染叶片组织衰老[25]。PTI和激素信号之间的交叉对话和对其产生影响的病原菌模拟正成为当前的研究热点。

3 对病原菌激活物的间接和直接寄主识别

使病原菌能克服PTI的激活物被特异性的抗病基因(R)所识别。大多数R基因编码NB-LRR蛋白，在拟南芥Col-0基因组中大约有125个。一旦某种激活物被对应的NB-LRR所识别，ETI就会启动发生。被识别的激活物被称为无毒蛋白(Avr)。ETI是一种更快更强烈的通常终止于HR反应之后的变体式的PTI[14，26]。典型的HR不会超越感染的细胞，它可以阻碍互作中的病原菌的生长，尤其是对那些具有吸盘的病原物。但对ETI而言HR是非必需的，也不常见。在大多数情况下实际上究竟生什么阻止了病原菌生长还未可知。

NB-LRR蛋白可能被胞质热休克蛋白90和其它的受体辅助伴侣折叠成信号能级状态。LRRs作为负控因子可阻止不适合的NB激活。NB-LRR激活涉及胞内和胞间分子构象变化，采用类似于“诱导邻近机制”，通过这种机制相关的动物Apaf-1蛋白可以激活程序性细胞死亡[27]。

NB-LRR激活可调动部分反应信号途径交互网络来区分活体营养与死体营养病原菌侵染[5]。这主要由水杨酸、茉莉酸和乙烯累积组合之间的平衡来维持的，水杨酸是针对活体营养病原真菌的局部和系统信号；茉莉酸和乙烯累积是启动对死体营养病原真菌防卫反应的信号[5]。其它的植物激素可能改变水杨酸-茉莉酸/乙烯信号平衡。拟南芥水杨酸合成和反应缺陷突变体的基础防卫反应和系统获得抗性(SAR)受到抑制[25]。NB-LRR激活诱导感染位点附近及系统中杨酸(SA)和ROS依赖反应的差异化。伴随ETI发生的依赖于NADPH氧化酶的氧化迸发，可抑制依赖于水杨酸的细胞死亡，从而控制植物感染点周围病原菌的扩散[28]。基因表达的局部和系统变化多半受WRKY和TGA家族转录因子所介导[29]。

几种NB-LRR蛋白可以通过探测激活物作用于寄主目标的产物而间接识别III型激活物，这与“看护假说”相一致。该假说的关键要点如下：(1)激活物作为毒性因子在寄主上有作用的目标；(2)通过控制或改变这个目标使病原菌能成功入侵感病基因型的寄主；(3)激活物干扰寄主目标会产生“病原菌诱导的自我修饰”分子模式，可以激活相应的NB-LRR蛋白从而导致ETI产生。这个模型被实验证据支持的三个重要结果如下：(1)多激活物能独立进化来控制相同的寄主目标；(2)这可能促进不只一个NB-LRR蛋白的进化，NB-LRR蛋白与多激活物的寄主目标相关联；(3)NB-LRRs可被通过不同的自我修饰模式的识别所激活，而这些不同的自我修饰模式是通过激活物作用于相同寄主目标而产生[6]。

RIN4是一个由211氨基酸、乙酰化的和胞膜关联的蛋白质，可作为被NB-LRR蛋白质看护的III型激活物作用于寄主目标的典型案例。RIN4受三种不同的细菌激活物的控制，且与拟南芥体内两种NB-LRR蛋白相关联。两种不相关联的III型激活物 AvrRpm1 和 AvrB，与RIN4相互作用，诱导RIN4的磷酸化。第三种激活物 AvrRpt2是一个半胱氨酸水解酶，在寄主细胞内被激活，可以在两个位点切割并去掉RIN4。RIN4的切割激活RPS2 NB-LRR蛋白。RPM1和RPS2的激活都需要GPI锚定的NDR1蛋白，RIN4可与 NDR1发生相互作用[30]。

如果RIN4是这三种激活物唯一的作用目标，那么去除RIN4后将会消除它们对弱致病菌株毒性增加的能力。但去除RIN4时，它在感病菌株中(rin4，rpm1， rps2) AvrRpm1 或AvrRpt2不是唯一的寄主目标[31]。而且AvrRpt2能离体切割几种拟南芥蛋白，这些蛋白包含一致的切割位点[30]。因此，任何激活物对毒性的作用可能涉及几种寄主目标的控制和几种自我修饰分子的产生。但是激活NB-LRR足以实现对RIN4的干扰。RIN4负控RPS2和RPM1。在rpm1和rps2植株中，AvrRpt2或AvrRpm1控制RIN4以抑制PTI[31-32]。因此植物利用NB-LRR蛋白防卫病原菌，而病原菌则调动激活物来抑制PAMP信号。

并非所有NB-LRR识别都是间接的，有Avr和NB-LRR直接互作的实例[33]。亚麻L座位等位基因编码NB-LRR蛋白，在酵母中NB-LRR蛋白与相应的AvrL蛋白互作，为激活物多样性决定NB-LRR识别与激活物NB-LRR蛋白互作紧密关联[33]提供了第一个证据。L和AvrL蛋白都处在多样性选择压力之下，通过直接的军备竞赛式的方式进化。其它真菌和卵生病原菌激活物和相应寄主NB-LRR蛋白的等位基因多样性也暗示着二者之间存在直接的相互作用，但这种相互作用还有待证实。

1.4～1.8亿万年以前，几万被子植物的进化年轮可能与许多病原菌共进化事件相伴而生，尤其是寄主适应的专化性活体营养型病原菌。多数植物抗多数病原菌的感染，它们认为是“非寄主植物”。这种非寄主抗性至少由两种机制介导，其一是某种病原菌的激活物可能对潜在的新的，但是进化上不同的寄主无效，这就导致很少或没有抑制PTI和病原菌生长的失败。其二是一种或多种可能的病原菌的激活物可被植物NB-LRR蛋白识别，从而产生ETI。由于启动防卫反应的进程和幅度不同，会产生不同的抗性结果，也会对它们产生不同的进化压力。

拟南芥对非适应的大麦病原菌B.graminisf. sp. hordei(Bgh) 非寄主抗性通常涉及到病原物进入位点的快速细胞壁沉积(物理障碍)和抗微生物代谢物产生，但没有HR发生。拟南芥渗透突变体(pen)在此反应中被部分抑制。PEN2是一个葡萄糖基过氧化物水解酶，PEN3编码胞膜ABC转运蛋白。PEN2和PEN3都被招募到真菌进入位点，介导毒素向质外体的极化转运[34-35]。肌动蛋白骨架作用于该反应，可能作为含过氧化物酶体和或囊泡的PEN2的轨道。这种前入侵的非寄主抗性与后入侵机制在遗传上是区分开的，后入侵机制需要PTI和ETI的调控因子。去除PEN2和PTI/ETI信号可将拟南芥转化成一个进化上的非适应真菌病原物的寄主[34]。这暗示非寄主抗性是由机械上可区分的不同层次的组分构成的。

PEN1突触融合蛋白在不同的非寄主抗性途径中发挥了作用。PEN1可能是三元SNARE复合物的一部分，该复合物分泌囊泡物质岛真菌侵染点，对细胞壁沉积物形成起作用[36-37]。特异性的7个跨膜MLO(白粉病抗性座位O)家族成员负控PEN1依赖的病原菌入侵位点的分泌。拟南芥或大麦隐性突变mlo导致对不同的共进化白粉病原菌的抗性。因此，无论是在拟南芥还是在大麦中，这种真菌可能通过激活MLO而抑制PEN1介导的抗病性。这一系列显著的发现意味着白粉真菌在单子叶和双子叶植物进化分支之时或以前就已经进化出了一种共同的寄主细胞进入机制。PEN2和PEN3基因可被flg22诱导表达，这表明它们可能参与了PTI。

非寄主抗性也能被平行的ETI反应所介导。例如，来自马铃薯病原菌的4个细菌激活物不能侵染寄居大豆，但来源于大豆病原菌，却能启动特异性的大豆R基因。从马铃薯病原菌中删除这些激活物基因会减轻对马铃薯的毒性，但却不能侵染大豆[6]。因此，在此病原菌菌株中可能缺乏某些因子，而这些因子对大豆侵染是必需的。一种广泛分布的单个多态性的激活物，作为一种无毒蛋白足以使稻瘟病(Magnaportheoryzae)菌株不能侵染水稻。在50多种菌株中出现的激活物能成功侵染多年生黑麦草，暗示着一种毒性功能存在[38]。拟南芥对油菜茎基溃疡病真菌(Leptosphaeriamaculans)非寄主抗性实际上受非连锁的NB-LRR蛋白控制，该蛋白存在两个杂交亲本材料之中[39]。因此，神秘的NB-LRR介导的平行的抗性反应能限制病原菌的寄主范围。

4 病原菌逃避寄主监视

ETI的有效性选择了微生物变异体，这些变异体逃避NB-LRR介导的特定的激活物的识别。激活物等位基因的频率可能会受其作用方式的影响。亚麻锈病菌AvrL等位基因和卵生菌Atr13和Atr1等位基因的多样性暗示着激活物存在某种特定的进化方式。这些无毒基因蛋白质可能在体内分别直接与亚麻L和拟南芥RPP1 、RPP13座位的等位基因编码的蛋白质相互作用。在激活物等位基因中高水平多样化的选择很可能被寄主所识别，而作用于可能对激活物功能不需要的残基上。

相对比，提供生化功能的激活物可能受负选择(纯化选择)，激活物产生的生化功能导致寄主目标的修饰。通过对病原菌诱导激活物自我修饰的识别而激活NB-LRR为寄主感知多激活物提供了一个机制，进化的多激活物可以抑制相同的寄主目标，通过选择产生能逃避ETI的激活物。假如群体的激活物总体上能涵盖对感病寄主潜在适合度的损失，那么，对寄主识别最简单的病原菌反应是放弃被探测的激活物基因。事实上激活物基因常与可移动的遗传因子或端粒相关联，且通常作为细菌和真菌菌株中被观察到的多态性(存在或缺失)。通过病原菌诱导的自我修饰的识别使激活物作用的间接识别作为一套得到相对稳定持久的和进化保护的细胞机器。

ETI也能通过病原菌激活物的进化被克服，进化的病原菌激活物可以直接抑制ETI。例如在菜豆假单胞菌(P.syringaepv.phaseolicola)中，AvrPphC激活物可以抑制由一些栽培菜豆品种AvrPphF启动的ETI，而AvrPphC可以限制不同菜豆栽培种的无毒性。亚麻锈病的遗传分析表明称之为抑制子的基因可以抑制由其它无毒基因启动的ETI[6]。因此，一些激活物抑制被其它激活物启动的ETI完全是可能的。

自然选择在无识别情况下维持激活物功能，但激活物功能是以依赖于相应R基因频率为代价的，而且R基因可能迫使寄主付出适合度代价[40]。因此，如果病原菌群体中激活物频率下降了，寄主就可能被相应R等位基因的丧失而被选择，这种依赖于频率的循环将持续下去。

5 讨论

对具有多种生活史的病原菌的激活物的作用方式及功能的深入研究，将有助于阐明所有寄主目标，也有利于阐明施加在寄主和病原菌上的进化压力。例如，如果大多数细菌激活物在负选择下进化以维持本能的内在功能，那么，群体范围的无关的微生物激活物可能交汇于NB-LRR相关的寄主目标，NB-LRR蛋白和寄主蛋白之间这种稳定的联系可能受到新进化的或新获得的激活物的挑战，其中寄主蛋白的完整性会受到监视，而激活物能秘密地控制与毒性抗衡的寄主目标。

高通量序列分析使得索引专化性活体营养病原菌基因数据成为可行，如白粉霜霉病和锈病。基因组学也可用来鉴定病原菌感染后表达的基因。信号肽和RxLR模体的存在能用来通过计算机分析鉴定候选激活物的数据。随着相适应的高通量传递系统的发展，使得对激活物的功能以及它们对PTI和/或ETI对寄主植物和其它植物的损害能力的研究成为可能[41]。

有关等位基因频率及其在野外生态系统中的空间分布将有助于了解了解病原菌激活物和其辅助进化的寄主NB-LRR基因的群体生物学，了解更多有关这种免疫系统的进化信息，也将告诉我们如何更有效地利用它来控制病害[42]。