GC-MS测定血清胆固醇及其标志物前处理条件正交试验优化研究

2016-07-12 12:46:32王栋芳罗世恒刘雅琼黄宁华闫赖赖王京宇
光谱学与光谱分析 2016年5期
关键词:皂化正己烷胆固醇

张 钰,王栋芳,曹 冰,罗世恒,刘雅琼,黄宁华,闫赖赖,王京宇*

1.北京大学公共卫生学院,北京 100191 2.岛津企业管理(中国)有限公司,北京 100020

GC-MS测定血清胆固醇及其标志物前处理条件正交试验优化研究

张 钰1,王栋芳1,曹 冰1,罗世恒2,刘雅琼1,黄宁华1,闫赖赖1,王京宇1*

1.北京大学公共卫生学院,北京 100191 2.岛津企业管理(中国)有限公司,北京 100020

采用正交试验优化GC-MS测定血清胆固醇及其标志物的样品前处理条件,并对最优试验方案进行方法学评价。采用L16(211)正交设计对影响GC-MS测定血清胆固醇及其标志物前处理的3个关键步骤共7个因素——皂化(KOH-乙醇浓度、皂化温度和时间)、萃取(正己烷用量)和衍生化(衍生化温度、时间和用量)进行优化。得到最优前处理条件组合如下:KOH-乙醇溶液浓度为1 mol·L-1; 皂化温度70 ℃; 皂化时间60 min; 萃取剂用量2 mL; 衍生化温度70 ℃; 衍生化时间60 min; 衍生化试剂用量100 μL。所建方法准确性和精密性良好,方法学评价指标优于文献报道。

GC-MS; 正交试验; 胆固醇; 标志物; 前处理

引 言

胆固醇是机体内重要的代谢组分之一,与人体健康和疾病密切相关。胆固醇的代谢与吸收是调节体内胆固醇平衡的两个重要途径[1],人体血清中含有如角鲨烯、2,4-脱氢胆固醇等胆固醇合成前体,可作为胆固醇合成标志物用于反映机体内源性胆固醇合成效率; 还含有如菜油固醇、β-谷固醇等植物固醇,可作为胆固醇吸收标志物用于反映机体外源性胆固醇吸收效率。将上述胆固醇合成标志物与胆固醇吸收标志物统称为胆固醇标志物[2-5]。胆固醇标志物的检测已应用于动脉粥样硬化、高血压、高胆固醇血症等疾病的检验[2-4]。因此,血清胆固醇标志物水平可以反映机体胆固醇合成与吸收状态并解释胆固醇水平变化的原因,可作为部分疾病预防及临床检验的重要指标。

目前,国内外检测血清胆固醇标志物较为常用的方法有气相色谱同位素稀释质谱法[6]、液相色谱同位素稀释质谱法[7]、高效液相色谱法[8]、高效气相色谱法[9]等。由于胆固醇及其标志物彼此之间化学性质和结构极其相似,且血清中标志物含量较低与胆固醇含量相差较大,用上述方法进行检测时较难实现完全分离。GC-MS(gas chromatography-mass spectrometer)以其灵敏度高、特异性强等特点在痕量检测方面具有很大优势,但该方法在同时检测血清胆固醇及其标志物检测方面的研究报道较少且方法研究中未分析影响因素间的交互作用。在GC-MS检测中最为重要的是样品前处理。故采用正交试验对GC-MS测定血清胆固醇及其标志物的前处理条件进行优化和分析,并对优化后的前处理过程进行评价,为胆固醇相关疾病的检测提供方法学基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC MS-QP 2010 Ultra型气质联用仪(岛津(中国)有限公司); AOC-20i型自动进样器(岛津(中国)有限公司); AY120电子天平(0.1 mg,岛津(中国)有限公司); HQ-60旋涡混合器(北方同正生物技术发展公司); HGC-12A氮气吹扫仪(天津恒奥科技发展公司); ON-450电热恒热干燥箱(ASONE株式会社); B-490恒温水温箱(BUCHI公司); LD5-2A离心机(北京医用离心机厂)。

角鲨烯标准品(99%); 2,4-脱氢胆固醇标准品(87.3%); 菜油固醇标准品(≈65%); β-谷固醇标准品(97%); 胆固醇标准品(97.7%); 内标5α-胆甾烷标准品(10mg/dl); 衍生化试剂(HMDS+TMCS+Pyridine=3∶1∶9),以上试剂均购自Sigma公司; 正己烷(99.9%分析纯,赛默飞世尔科技有限公司)、氢氧化钾(≥82.0%分析纯,北京化工厂)、无水乙醇(99.9%分析纯,韩国德山药品工业),超纯水(25 ℃电阻率18.2 MΩ·cm,Milli-Q Reference型超纯水系统)。

经医院体检健康的成年人空腹静脉血清,置-20 ℃冷藏备用。

1.2 正交试验因素及水平

GC-MS测定血清胆固醇及其标志物前处理过程中最关键三个环节,即皂化、萃取和衍生化。通过正交试验对以上关键环节的试验条件进行优化。考虑因素间存在交互作用,故选用L16(211)正交表,考察7个独立因素(A.皂化剂KOH-乙醇浓度、B.皂化温度、C.皂化时间、D.萃取剂用量、E.衍生化温度、F.衍生化时间、G.衍生化试剂用量)以及4个交互作用(A×B,B×C,A×C和E×F)对样品前处理在GC-MS测定血清胆固醇及其标志物过程中的影响,上述各因素的水平设定参考相关文献[10-12]。

表1 正交试验因素及水平

1.3 溶液配制

(1)标准溶液配制:精确称取角鲨烯、2,4-脱氢胆固醇、菜油固醇、β-谷固醇和胆固醇的标准品,以正己烷为溶剂分别配制并逐级稀释成一系列浓度梯度的混标溶液(表2),置-20 ℃储存备用。

表2 混合标准溶液浓度系列(mg·L-1)

(2)内标溶液配制:精密称取5α-胆甾烷标准品,以正己烷为溶剂配制内标溶液浓度为0.5×10-2mg·L-1,置4 ℃储存备用。

1.4 样品处理

取血清样品100 μL于10 mL离心管中,加入100 μL内标溶液和1 mL KOH-乙醇溶液,涡旋混匀30 s后置于水浴锅中进行皂化反应。冷却至室温后,加1 mL超纯水和一定量正己烷,涡旋1 min,3 500 r·min-1离心3 min,取上清,重复两次合并上清。N2吹干(40 ℃)后加入衍生化试剂,涡旋30 s,置烘箱中反应,冷却至室温后N2吹干,加入600 μL正己烷复溶,涡旋混匀30 s,3 500 r·min-1离心3 min,取上清至样品瓶,分析备用。

正交实验按照基本过程操作,其中KOH-乙醇溶液浓度、皂化温度、皂化时间、正己烷用量、衍生化温度、衍生化时间和衍生化试剂用量等按照表1正交设计水平进行。

1.5 仪器测定条件

表3 特征离子与定量离子

1.6 统计分析

采用岛津公司GC-MS postrun analysis软件测定各组分峰面积,对正交试验所得各组分峰面积进行百分制处理和赋予等权重处理,依次进行结果直观分析和多因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果

按照L16(211)正交表设计且考虑因素间交互作用,共有16个试样,均按照1.4所述操作,分别将各组分以各自峰面积最大值为100进行百分制转换,对每个试样各组分百分制得分等权重加权平均,得到该试样综合得分(Y),并对其进行统计分析(表4)。

极差直观分析可知各因素对结果影响大小的依次顺序是:C>B>E>A>F>E×F>B×C>G>A×C>D>A×B,根据每一因素各自试验结果指标的均值(Ⅰ,Ⅱ)可以判断因素的最优水平,第一水平为最优的因素有A×C和D,其他因素均为第二水平为最优水平。

方差分析结果发现KOH-乙醇溶液浓度、皂化温度、皂化时间、皂化温度与皂化时间的交互作用、衍生化温度、衍生化时间和衍生化温度与衍生化时间的交互作用对试验结果的影响有统计学差异(p<0.05),而KOH-乙醇溶液浓度与皂化温度的交互作用、KOH-乙醇溶液浓度与皂化时间的交互作用、萃取剂用量和衍生化试剂用量对试验结果的影响没有统计学差异(表5)。

表4 正交试验设计及结果

表5 方差分析结果

F0.05(1, 1)=161.00

分别对皂化反应、衍生化反应温度与时间的交互作用做进一步分析,发现皂化条件的最佳组合为70 ℃,60 min; 衍生化条件的最佳组合为70 ℃,60 min(表6)。

通过正交试验得出GC-MS测定血清胆固醇及其标志物的最优前处理条件为:KOH-乙醇溶液浓度为1 mol·L-1,皂化温度70 ℃,皂化时间60 min,萃取剂正己烷用量为2 mL,衍生化温度70 ℃,衍生化时间60 min,衍生化试剂用量100 μL。将最优前处理条件代入1.4所述基本过程中,建立GC-MS测定血清胆固醇及其标志物的方法。

表6 因素交互作用结果

2.2 方法学评价

2.2.1 线性关系与检出限

分别取表2中标准溶液梯度系列1~6号100 μL,采用正交设计分析得到的最优前处理方案,按照1.4所述逐步操作,以各组分与内标的浓度比为横坐标,以峰面积比值为纵坐标进行拟合,分别计算线性回归方程,各组分在梯度范围内线性关系良好。以信噪比S/N=3为衡量标准,所对应的浓度为各组分最低检出限(表7),色谱图见图1。

2.2.2 日内精密度

采用正交试验分析所得最优前处理方案,按照1.4所述逐步操作,连续测定3次,计算角鲨烯、2,4-脱氢胆固醇、菜油固醇、β-谷固醇和胆固醇的日内精密度,分别为1.73,1.84,2.04,1.76和1.91,均在2.1%以下,表明该方法日内精密度良好。

表7 回归方程及线性范围、相关系数和检出限

图1 GC-MS测定胆固醇及其标志物TIC色谱图

2.2.3 日间精密度

采用正交试验分析所得最优前处理方案,按照1.4所述逐步操作,连续测定5天,计算角鲨烯、2,4-脱氢胆固醇、菜油固醇、β-谷固醇和胆固醇的日间精密度,分别为7.47,2.41,4.26,4.20和4.48,均在10%以下,表明该方法日间精密度良好。

2.2.4 回收率

取健康人血清100 μL,按照1.4所述处理并测定血清中各组分浓度,另分别取该血清100 μL加入低、中、高3个水平100 μL的混合标准溶液(1号、3号、5号梯度混标溶液),按照1.4所述处理,计算平均回收率及RSD%,结果显示各目标物的平均回收率均在97.96%~102.76%之间且RSD%均小于4%(表8)。

表8 回收率结果

2.3 正交试验

皂化:常采用碱性醇溶液(KOH-乙醇溶液)使结合固醇水解为游离状态以测得血清中固醇类成分总量[10],另外皂化是一种化学反应,其反应程度受时间与温度的影响,故对以上因素进行考察,结果发现KOH-乙醇溶液浓度、皂化温度和皂化时间对测定结果的影响有统计学差异且皂化温度与时间的交互作用对测定结果的影响也具有统计学意义,皂化60 ℃ 45 min与60 ℃ 60 min结果相比差异较大,而皂化70 ℃ 45 min与70 ℃ 60 min结果相比差异较小,皂化温度越高皂化反应越快,在本试验时间和温度范围内,时间越长温度越高,皂化效果越好,皂化70 ℃,60 min为最佳条件。

萃取:胆固醇及其标志物均为脂溶性物质,在皂化反应完成后需采用液相萃取的方法将其从溶剂中萃取出来。萃取前加入超纯水可使水相与正己烷相分层更显著,萃取重复进行两次以保证最大程度将待测物溶出,考虑到萃取剂正己烷用量对萃取结果存在影响,故对其进行考察,结果发现正己烷用量在多于2 mL时对测定结果的影响无统计学差异,故采用2 mL正己烷进行萃取以避免试剂不必要的浪费和缩短后续N2吹干时间。

衍生化:衍生化反应能够提高检测物灵敏度和稳定性,降低色谱柱壁对样品的吸附作用,有利于结构相似的组分彼此分离[13]。衍生化反应的影响因素主要有衍生化温度、衍生化时间和衍生化试剂用量。结果发现衍生化温度和时间对测定结果的影响具有统计学意义且衍生化温度与时间之间存在交互作用,60 ℃衍生化45 min与60 ℃衍生化60 min相比差异较大,而70 ℃衍生化45 min与70 ℃衍生化60 min相比差异较小,温度在对衍生化反应程度的影响中发挥更大的作用,在本试验时间和温度范围内,时间越长温度越高,皂化效果越好,衍生化70 ℃ 60 min的测定结果为最佳条件。衍生化试剂用量在多于100 μL时对测定结果的影响并无统计学意义。

2.4 方法学评价

优化后的样品前处理方法不仅可以对各组分进行较好的分离和测定,且该方法线性拟合度、精密性、稳定性和回收率均较好。除胆固醇外,其余各组分相关系数r值均大于0.999 6; 胆固醇回归方程r值为0.998 8,其原因可能是由于胆固醇浓度远大于内标和其他组分浓度而使拟合度不如其他组分; 该方法测得各组分日内精密度均在2.1%以下,各组分日间精密度均在10%以下,各组分回收率均值均在97.96%~102.76%之间且RSD%均小于4%。与同类方法学评价结果相比,该研究各组分标准曲线拟合度更高; 检出限除角鲨烯略高外,其他组分均低于文献报道3~10倍; 各组分日内精密度与日间精密度均优于文献报道; 胆固醇回收率与文献报道持平,其余组分回收率均优于文献报道(表9)。

表9 同类文献方法学结果对比

3 结 论

采用正交试验对GC-MS测定血清胆固醇及其标志物的前处理条件进行优化,探讨了前处理主要影响因素及因素间交互作用对测定结果的影响。所建方法具有良好的灵敏度和准确性,能够同时测定角鲨烯、2,4-脱氢胆固醇、菜油固醇、β-谷固醇和胆固醇浓度,且方法学评价的大部分指标优于文献报道。该方法为机体代谢过程中胆固醇及其标志物相互关系的研究奠定了较为可靠的分离测定基础。

[1] Gylling H.International Journal of Clinical Practice, 2004, 58(9): 859.

[2] Mia Hedman, Miettinen Tatu A, Gylling Helena, et al.The Journal of Pediatrics, 2006, 148(2): 241.

[3] Miettinena Tatu A, Gylling Helena, Viikari Jorma, et al.Atherosclerosis, 2008, 200(1): 177.

[4] Silbernagel Guenther, Fauler Guenter, Renner Wilfried, et al.Journal of Lipid Research, 2009, 50(2): 334.

[5] Miettinen T A, Gylling H, Nissinen M J.Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases, 2011, 21(10): 765.

[6] Edwards Selvin H, Kimberly Mary M, Pyatt Susan D, et al.Clinical Chemistry, 2011, 57(4): 614.

[7] Zhou W, Li H, Dong J, et al.Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2011, 49(4): 669.

[8] Hojo Kazuhiro, Hakamata Hideki, Takahashi A, et al.Journal of Chromatography B, 2011, 879(11-12): 751.

[9] Briche Céline S J Wolff, Carter David, Webb Kenneth S.Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2002, 16(9): 848.

[10] ZHANG De-ting, FANG Shen-hui, PAN Li-qin, et al(张德亭, 方深慧, 潘利琴, 等).Chinese Journal of Health Laboratory Technology(中国卫生检验), 2014, 24(6): 838.

[11] WANG Fang-jie, GUO Cheng-xian, XIAO Shan, et al(王方杰, 郭成贤, 肖 珊, 等).Chinese Pharmaceutical Journal(中国药学), 2012, 47(7): 560.

[12] Amaral C, Gallardo E, Rodrigues R, et al.Journal of Chromatography B, 2010, 878(23): 2130.

[13] CAI Pin-pin,LU Hong-mei (蔡品品, 卢红梅).Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化学), 2013, 41(8): 1183.

(Received Mar.12, 2015; accepted Jul.16, 2015)

*Corresponding author

Orthogonal Experiment for Optimization of the Sample Pretreatment Conditions for the Serum Cholesterol and Markers Determination by GC-MS

ZHANG Yu1,WANG Dong-fang1,CAO Bing1,LUO Shi-heng2,LIU Ya-qiong1,HUANG Ning-hua1,YAN Lai-lai1,WANG Jing-yu1*

1.School of Public Health, Peking University, Beijing 100191, 2.Shimadzu(China)Co., Ltd., Beijing 100020, China

The objective is to use orthogonal experiment to optimize the pretreatment on the determination of serum cholesterol and its markers by GC-MS.And then the method is evaluated in a methodological perspective.The methodis to Use L16(211) orthogonal experiment design to observe the influence of three key steps,althogether seven factors of pretreatment, which are saponification (KOH ethanol solution concentration, temperature and time), extraction (dose) and derivatization (temperature , time and dose).As for the results,the conditions of optimal pretreatment are as follows:the ethanol solution is 1 mol·L-1KOH, the saponification temperature is 70 ℃;the saponification time is 60 min;the Solvent quantity is 2 mL; the derivatization temperature is 70 ℃;the derivatization time is 60 min,and the derivatization agent is 100 μL.Through the optimization by orthogonal design and methodological evaluation, the determination of serum cholesterol and its markers by GC-MS is excellent in terms of accuracy and precision, and methodological evaluation indexes are better than those reported in other papers.

GC-MS; Orthogonal experiment; Cholesterol; Markers; Pretreatment

2015-03-12,

2015-07-16

北京大学医学交叉学科种子基金项目(BMU20140435)资助

张 钰,女,1989年生,北京大学公共卫生学院硕士研究生 e-mail: zhangyu2012pku@163.com *通讯联系人 e-mail: wjy@bjmu.edu.cn

R113

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1488-06

猜你喜欢
皂化正己烷胆固醇
谈谈胆固醇
保健医苑(2022年1期)2022-08-30 08:39:52
降低胆固醇的药物(上)
中老年保健(2022年3期)2022-08-24 02:58:40
降低胆固醇的药物(下)
中老年保健(2022年4期)2022-08-22 02:59:58
正己烷在不同硅铝比HZSM-5分子筛上吸附的分子模拟研究
利用废旧轮胎橡胶颗粒吸附VOCs的研究
应用化工(2021年4期)2021-05-20 09:43:36
溶剂解析气相色谱法对工作场所空气中正己烷含量的测定
化工管理(2020年26期)2020-10-09 10:05:16
正己烷-乙酸乙酯共沸物萃取精馏工艺模拟研究
山东化工(2019年2期)2019-02-21 09:29:32
轿车等速传动轴精密锻件皂化工艺研究
胆固醇稍高可以不吃药吗等7题…
饮食科学(2017年12期)2018-01-02 09:23:27
隔夜皂化法测定白酒总酯的不确定度分析
中国酿造(2014年9期)2014-03-11 20:21:13