牡丹花黄酮的抗氧化活性研究

窦勇博

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）



牡丹花黄酮的抗氧化活性研究

窦勇博

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

摘要：牡丹是中国特有的木本名贵花卉，素有“花中之王”的美称。黄酮类化合物广泛存在自然界各类植物中，多以苷类形式存在。本实验分别从DPPH·清除能力、·OH清除能力和还原力等三个方面，研究了牡丹花黄酮的抗氧化活性，结果表明：牡丹花黄酮能够清除DPPH·自由基和·OH自由基，同时也具有一定的还原力，牡丹花黄酮对DPPH·和·OH的半清除浓度（IC50）分别为259.29μg/mL和1573.53μg/mL，每克牡丹花黄酮的还原力相当于213.07mg抗坏血酸和993.67mg芦丁的还原力。

关键词：牡丹花；黄酮；抗氧化性

牡丹是中国特有的木本名贵花卉，素有“花中之王”的美称。黄酮类化合物广泛存在自然界各类植物中，多以苷类形式存在。黄酮类化合物又称黄体酮、生物类黄酮、黄碱素、维生素P，泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮常用的提取方法有传统提取法、超声波提取法、微波萃取法和酶解法等[1]。

近年来随着对黄酮类化合物的不断研究，许多不同的天然黄酮类化合物化合物被开发出来，加之对其药理作用的深入研究，发现其对机体具有许多的生理活性，包括清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗肿、抗过敏、抗菌、抗炎、抗糖尿病、抑制酶的活性、防止血管舒张等作用。另外，黄酮类化合物在食品医药领域的应用前景也是非常的广阔。由于黄酮类化合物分子中含有酚羟基，可有效清除生物体内的氧自由基，是一种天然的抗氧化剂。如花青素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生[2]。黄酮类化合物通过调节抗氧化酶系统，增强肿瘤细胞中的抗氧化酶活性，降低细胞内活性氧的浓度，选择性杀伤肿瘤细胞，从而有效抑制肿瘤细胞的快速增殖，因此达到抗癌的作用[3,4]。

1　材料与设备

1.1材料与试剂

芦丁、乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁，天津大茂化学试剂厂。氢氧化钠、DPPH，天津富宇精细化工有限公司。抗坏血酸、醋酸镁、草酸、水杨酸、磷酸，天津博迪化工股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

小型植物粉碎机，XFB-400，吉首市中诚制药机械厂；旋转蒸发仪，RE100-Pro，上海人和科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，UV-1800，岛津国际贸易有限公司；水循环真空泵，SHB-III，北京博远祥德科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9140A，上海精宏实验设备有限公司；数控超声波清洗器，KQ-300DB，北京卓信伟业科技有限公司；电子天平，YP3001 N，上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅，HWoSY21-K，北京市长风仪器仪表有限公司；pH计，PHSJ-5，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3黄酮类化合物的提取

根据前期试验测出提取黄酮的最佳条件是：乙醇浓度60%、提取温度60℃、提取时间40min、料液比1:30，在此基础上，用超声波浸提法来提取牡丹花中总黄酮。提取流程为：牡丹鲜花→分拣→低温烘干→粉碎→超声波辅助提取→抽滤→真空浓缩→冷冻干燥→粗黄酮提取液。

将低温冷冻的牡丹花50℃低温烘干，粉碎机破碎，精确称取牡丹花粉末1.0g，以70%的乙醇溶液为溶剂，料液比为1:30，超声辅助浸提40min，浸提液经抽滤后，加入相应浓度的乙醇定容于100mL容量瓶中作为提取液[5]。

1.4黄酮抗氧化性质的研究

1.4.1清除DPPH·能力的测定

精确称取DPPH标准品20.5mg，以95%乙醇为溶剂并定容至250mL容量瓶中，即配制成浓度为2×10-4mol/L 的DPPH·乙醇溶液。

精确移取2.0mL（待定）黄酮溶液于10mL试管中，分别加入2.0mL配制好的DPPH·乙醇溶液，摇匀，室温下放置30min，以95%乙醇调零，在517nm处测得吸光度值1。同时，精确移取2.0mL黄酮溶液与2.0mL 95%乙醇混合后在517nm处测得吸光度值2，然后精确移取2.0mL配制好的DPPH·乙醇溶液与2.0mL95%乙醇混合后在517nm处测得吸光度值0，牡丹花黄酮对DPPH自由基清除率计算公式如下：

1.4.2清除·OH能力的测定

依次精确移取1mL 0.15mol/L FeSO4、1mL 2mmol/L水杨酸溶液、1mL（参照腊梅花）的牡丹花黄酮溶液、1mL 6mmol/L H2O2于试管中，最后加入H2O2启动反应。于37℃水浴反应0.5h，以蒸馏水为参比，测定不同浓度黄酮溶液在510nm处的吸光值。以1mL 0.15mol/L FeSO4，1mL 2mmol/L水杨酸溶液，1mL不同浓度的牡丹花黄酮溶液，1mL蒸馏水作为牡丹花黄酮的样品对照组，牡丹花黄酮对·OH清除率计算公式如下：

1.4.3还原力的测定

取待测样品液2.5mL，加入 2.5mL磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH 6.6）及2.5mL1%的铁氰化钾溶液。50℃水浴反应20min后快速冷却至室温，加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混匀后3000r/min离心10min；取2.5mL上清液，依次加入2.5mL蒸馏水及0.5mL 0.1%的三氯化铁。混合均匀，静置10min后于700nm处测得吸光度值。吸光度值越大，表示还原力越强。

以抗坏血酸浓度与其吸光度作图，求出标准曲线方程；将样品的吸光度代入标准曲线方程，求出相对应的抗坏血酸浓度，最终将样品的还原力表示为1g牡丹黄酮中含Xmg抗坏血酸的还原力。

2　结果与分析

超氧阴离子自由基对人体的危害特别大，牡丹花中的黄酮酚羟基能够提供氢质子，使氧化性的超氧阴离子自由基发生还原反应，从而终止自由基链式反应。DPPH·自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基[20]，加入牡丹黄酮后，具有清除DPPH·自由基的作用。根据线性回归方程，可分别求出牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁的半抑制浓度IC50。IC50值即清除率达到50%时所需药物的浓度，IC50值的大小表明了抗氧化剂清除自由基的能力高低，一般情况下IC50值越小，抗氧化剂的清除能力越强[6]。

目前有关牡丹花黄酮的抗氧化活性的研究相对较少。本实验以抗坏血酸和芦丁为参照，研究了黄酮样品的还原力以及DPPH·和·OH清除活性。

2.1黄酮的DPPH·清除能力

如图1所示，牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁对DPPH·的清除活性均随浓度的增大而逐渐增大，量效关系显著。相同浓度条件下，牡丹花黄酮的清除DPPH·能力低于抗坏血酸和芦丁。根据线性拟合方程求出牡丹花黄酮的半清除浓度（IC50）为259.29μg/mL（见表1）。

图1　牡丹花黄酮对DPPH·的清除作用

表1　牡丹花黄酮对DPPH·的半清除浓度（IC50）

2.2黄酮的·OH清除能力

图2　牡丹花黄酮的·OH清除能力

由图2可知，牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁对·OH清除活性均随浓度的增大而逐渐增大，量效关系显著。相同浓度条件下，牡丹花黄酮的·OH清除能力比抗坏血酸和芦丁要低些。根据线性拟合方程求出牡丹花黄酮对· OH半清除浓度（IC50）为1573.53μg/mL（见表2）。

表2　牡丹花黄酮对·OH的半清除浓度（IC50）

2.3黄酮的还原力

图3显示了黄酮的还原力，由图3知，牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁的还原力均随浓度的增大而增大，量效关系显著。同浓度条件下，牡丹花黄酮的还原力比抗坏血酸和芦丁要低。经计算，1g牡丹花黄酮的还原力相当于213.07mg抗坏血酸和993.67mg芦丁的还原力（见表3）。

图3　牡丹花黄酮的还原力

表3　牡丹花黄酮的还原力

3　结论与展望

本文采用生物、物理及化学的原理，研究了菏泽地区栽种的牡丹花黄酮的抗氧化活性。根据最佳提取条件提取牡丹黄酮，然后研究了抗氧化性能的差异。分别采用DPPH·自由基体系、·OH自由基体系和还原力测定体系，对牡丹花黄酮的抗氧化性能进行了测定比较，并用抗坏血酸和芦丁作为对照。实验结果表明：牡丹花黄酮能够清除DPPH·自由基和·OH自由基，同时也具有较强的还原力。牡丹花黄酮的还原力均随浓度的增大而逐渐增大，量效关系显著；相同浓度条件下，牡丹花黄酮的还原力比抗坏血酸和芦丁要低些。

本文中所提取的黄酮为牡丹花中的总黄酮，若能采用柱层析、旋转蒸发仪等方法对粗提物进行分离，采用高效液相色谱、质谱等方法对牡丹黄酮化合物进行结构鉴定，实验结果将更有说服力。关于分子印迹技术[7]在牡丹黄酮领域的应用，研究相对来说比较少，尚处于探索阶段，将其直接应用于黄酮提取的关键问题尚未解决，今后应该加强这方面的基础研究，积累相关的数据，解决大规模提取分离工艺条件和设备方面的问题，促进分子印迹技术的不断发展。随着对分子印迹技术研究的不断深入，其实际应用的问题将得到解决，分子印迹技术将在天然活性产物的开发利用方面发挥其巨大的价值。

参考文献：

[1]程源斌.中原牡丹花黄酮的检测、纯化及抗氧化活性研究[D].郑州:河南科技大学,2011.

[2]谢田伟.枇杷花黄酮与精油的提取及其性质分析研究[D].厦门:集美大学,2012.

[3]Zhou T R.Inhibition of murine bladder tumorigenesis by soy Isoflavonoids via alterations in the cell cycle,apoptosis and angiogenenesis[J].Cancer Res.1998:5231-5238.

[4]朱俊东,杨家驹.大豆异黄酮抗癌作用研究进展 [J].国外医学·卫生学分册,1998:257-260.

[5]裴咏萍,李维林,张涵庆.三氯化铝比色法测定中药中总黄酮含量的方法改进[J].现代中药研究与实践,2009,23(4):53-55.

[6]田云.几种植物抗氧化剂制备、评价与应用初步研究[D].长沙:湖南大学,2004.

[7]宋可珂.玫瑰花黄酮提取分离及抗氧化性能研究 [D].北京:北京林业大学,2012.

Study on Antioxidant Activity of Flavonoids Peony

DOU Yong-bo
(Jinan Fruit Research Institute All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:The peony is China's characteristic of woody rare flowers.Flavonoids widely exist in many kinds of plants,and in the form of glycosides.The antioxidant activity of flavonoids of peony were studied from 3 aspects of DPPH·scavenging activity,·OH scavenging activity and reducing power in this experiment.The results showed that flavonoids of peony have reducing power and scavenging activity of·OH and DPPH·.The IC50 of scavenging activity of DPPH·and·OH were 259.29μg/mL and 1573.53μg/mL,the reducing power of per gram flavonoids of peony flower was equivalent to 213.07mg of ascorbic acid and 993.67mg of rutin.

Key words:Peony;flavonoids;antioxidation

中图分类号：O65

文献标志码：A

文章编号：1008-1038(2016)04-0023-04

收稿日期：2015-08-16

作者简介：窦勇博，男，研究方向为食品生物科学