培养基对酵母生长及蓝莓酒质量的影响

霍雨霞　萨玉龙

（呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000）



培养基对酵母生长及蓝莓酒质量的影响

霍雨霞萨玉龙

（呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000）

摘要：为探讨培养基对活性干酵母生长及酿造果酒质量的影响，以酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培养基为对照，选取蓝莓果浆、麦芽汁等成分改良活化培养基。结果表明：葡萄糖和酵母粉含量对酵母活化影响显著，添加蓝莓果浆、麦芽汁以及葡萄糖等成分优化的培养基活化效果优于对照（YEPD）。该系列培养基上酵母能够快速生长增值，死细胞率低；与对照相比，酿造的蓝莓酒残糖和高级醇含量降低，酯类物质含量最高提升12.1%，酒香浓郁。当培养基麦芽汁浓度超过3%，活化效果不会随着麦芽汁浓度升高而显著增加。改良后的培养基在提供酵母菌所需营养的同时提高酵母对蓝莓果浆中糖类和氨基酸等物质的利用率，使酒口感和香气物质更加平衡。

关键词：活性干酵母；活化培养基；筛选；蓝莓酒；质量

活性干酵母广泛用于果酒工业，能有效控制酒精发酵进程，生产出质量均一的酒。使用前需要进行活化处理，使酵母膜透性和细胞功能完全复原。正确的复水方法可以充分发挥活性干酵母的性能，获得理想的发酵产品。活化的一般步骤为37°C下蒸馏水中复水溶解30min左右后，接种扩大发酵，但此方法酵母生长容易受到抑制，接种到发酵液后难以快速启动发酵，因此如何快速有效地使干酵母复水活化对果酒生产尤为重要。

果酒用活性干酵母应用研究已有近50年的历史[1]，Kraus等通过比较选取了9种商用干酵母，比较其在不同温度的葡萄汁和纯水中的酵母复水活化效果，发现在最适温度范围内两种培养基成分下活化效果存在差异[2]。复水的主要问题是粘结或者营养不良造成酵母生长迟缓，活化培养基中添加一定碳氮元素、金属离子及抗氧化物质能够影响酵母细胞膜透性，进而对其核苷酸、细胞内的水溶物含量产生影响，有利于酵母生长繁殖[3]。常用细胞计数、CO2产率等作为指标以确定酵母活化和接种的最佳条件和时间[4]。目前，国内外关于酵母复水活化温度对酵母生长状态和果酒质量的影响研究较多，但是对干酵母复水过程中生长和营养消耗以及接种后对果酒质量的持续影响问题关注不够，至今尚无特定某种果酒干酵母活化培养基优化配制方面的报道。本文通过研究活化培养基成分对酵母活化状态、死细胞数、耗糖产酒精能力以及所产蓝莓原酒挥发性物质影响，综合分析可能的产生机理，以确定出最优化的活化培养基，为发酵食品生产提供理论和实践基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

葡萄酒活性干酵母CY3079，BDX购于加拿大拉曼集团罗赛尔公司。ZymafloreRX60，ZymafloreX5购于法国拉佛特公司。蓝莓购于海拉尔市场，挑选无腐烂、无变质的果实。

培养基配料：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉，均为分析纯，购自于上海蓝季科技发展有限公司。麦芽，购自于华润（天津）啤酒厂。

SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司；YS100光学显微镜，日本Nikon公司；固相微萃取，配备PDMS/CAR/DVB头，美国色谱科公司；MS4000气质色谱联用仪，美国瓦里安公司。

1.2实验方法

1.2.1麦芽汁制备

取1kg大麦芽经粉碎后，转入4L水的糖化锅中，60°C不断搅拌下，糖化、过滤、煮沸、冷却，再经过过滤或离心后所得上层清液即为制备所得麦芽汁。糖化标准以碘液滴定不变蓝为终点。

1.2.2活化培养基成分确定

以YEPD为对照培养基，对其中主要的组分进行消减法处理，找出对酵母活化影响最为显著的成分进行优化改良，培养基编号及成分见表1，每种培养基设置三个重复，分别接种到蓝莓果浆中进行发酵。

表1　培养基成分设计Table 1 Design of the culture medium component

1.2.3酵母形态评价及血球计数

对酵母复水后生长状态的观察使用美蓝染液水浸片法，参考沈萍等《微生物学实验》并做微调改动：滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，吸取少许酵母培养液置于染液中，混合均匀。然后用镊子取盖玻片盖在培养液上。将制片放置3min后，用低倍镜和高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况[5]。

酵母菌的计数，使用血球计数法，透明无色的为活酵母细胞，被染成蓝色的为死亡的酵母细胞。染色30min后再次观察，观察死活细胞比例的变化[6]。

1.2.4蓝莓果酒酿造工艺

主要参考Withy和Lodge的酿造工艺，并稍作改动，在得到原酒后进行澄清，然后对其指标进行检测[7]，具体步骤如下：

蓝莓→清洗→榨汁→过滤分离→果汁→成分调整→接种发酵→换罐陈酿→原酒→过滤→检测。

1.2.5酒精度和还原糖含量测定

酒精含量采用蒸馏法测定：取上清液，按照Miller等的方法，使用DNS试剂，通过测定540nm波长下的光吸收值来确定还原糖的含量，并以葡萄糖为标准表示[8]。

1.2.6香气物质分析

蓝莓原酒香气成分的萃取：在15mL装有微型磁力搅拌子的顶空瓶中加入NaCl（添加量为0.25g/mL）：取5mL待测蓝莓原酒插入PDMS/CAR/DVB固相微萃取头（Supelco公司，美国），于45°C下磁力搅拌吸附45min，GC解吸15min。

气谱条件参照Howard等方法并稍作改动[9]。初始温度为35°C，保持8min后，以3°C/min升温至134°C，保留2min。再以20°C/min升至250°C，保持3.5min，整个过程持续50min。载气为高纯度He气，流速为0.8mL/min。检测器和进样口温度为250°C。

质谱条件：EI电离源，电子能量70eV。电子倍增器电压1200V，扫描范围25～400amu。离子源温度220°C。

识别的挥发性物质通过NIST谱库进行识别，采用面积归一法测出各物质比例含量。

1.3数据处理

所有数据均为3次平行的平均值。数据处理与统计分析采用SPSS13.0中的ANOVA进行显著性方差分析。应用LSD法进行多重比较分析，并通过相关性矩阵进行不同组分间的相关性分析。

2　结果与讨论

2.1培养基成分对酵母生长的影响

2.1.1培养基对酵母生长状态的影响

复水活化前30min，YEPD培养基活化的活性干酵母生长缓慢，细胞间形态差异较大，美蓝染色后发现死细胞数较多，并且出现了四分体和芽孢态。在蓝莓果浆的K1培养基上，酵母的生长情况未能显著改善，仍处于受抑制状态。对采用消减法配制的一系列培养基（P1，J1及D1）中酵母生长状态观察：在P1和J1上酵母菌生长显著受到抑制，而使用D1培养基的酵母菌活化效果比P1和J1更好。培养基M1至M4的酵母形态比较均匀，美蓝染色后发现酵母细胞生长状态良好。

图1中，活化1h后对各组活化培养基上酵母进行染色计数，发现YEPD培养基上生长的酵母菌落数和死细胞率与K1培养基接近，约为45%左右。优化改进培养基成分，发现强化葡萄糖和麦芽汁的培养基（P1，M1-M4）相比另外几种培养基酵母生长状态较好，死细胞率显著降低，D1中缺少葡萄糖，死细胞率最高，约为75.6%，M1培养基上酵母生长迅速，活化后菌落数达到4.72×1010。

图1　培养基对酵母生长的影响Fig.1 The effect of medium on the growth of yeast

酵母菌理想的活化生长状态是分散均一，呈现椭球形、卵形，若遇到不适宜生长环境或者营养不足则会出现畸形，如假菌丝、四倍体，甚至出现芽孢和絮凝态，这是酵母自我保护机制作用的结果，但当逆境状态持续一段时间后就会形成伤害。逆境态活化培养的酵母菌扩培到发酵液以后，造成启发缓慢，逆境下产生的物质对酒的质量产生不良影响。通过消减法对几种培养基上酵母生长状态和死细胞率发现，与蛋白胨相比，葡萄糖和酵母粉对酵母活化影响显著，这主要由于加入的葡萄糖，能够减少细胞内含物的泄漏，对细胞膜起稳定作用[10]。而在YEPD中添加蓝莓果浆后对酵母活化效果不够显著，说明蓝莓果肉较难被酵母菌直接利用。麦芽汁中含有麦芽糖、葡萄糖、果糖等多种糖类，扩大酵母菌对麦芽汁利用范围，并且麦芽汁含有矿质元素等，有利于酵母菌维持细胞形态，补充营养物质，促进其生长代谢。

2.1.2培养基对酵母发酵效率影响

由图2可看出，几种培养基上生长的酵母菌在前期对糖类消耗较慢，后期大量消耗糖类。从接种第24h开始添加麦芽汁的培养基M1至M4还原糖降低速率均显著高于YEPD培养基。经麦芽汁培养基活化，酵母菌能够快速利用还原糖，发酵结束后对还原糖的测定发现，于M1-M4培养基复水活化的活性干酵母对葡萄糖的利用率显著高于YEPD（＜0.05）。

图2　培养基对蓝莓酒中还原糖含量影响Fig.2 The effect of culture medium on the content of reducing sugar in buleberryfruit wine

不同生长状态和阶段的酵母菌对糖的利用率和产物存在差异[11]。由于醇类主要由酵母的无氧呼吸产生，受酵母菌数目和生长状态影响显著。酵母适宜活化后能够快速进入生长繁殖状态，对还原糖消耗主要通过其呼吸作用进行消耗，产率和酵母活细胞数直接相关。复水活化培养基（M1-M4）中添加的蓝莓果汁和发酵液营养成分部分相似，复水对酵母菌有一定的驯化作用，酵母菌快速生长，缩短了发酵周期，并且提升了对不良环境的适应能力，且能够有效利用发酵液中的糖分等营养物质，达到需要的产物[12]。

2.2培养基对酵母菌产香影响

2.2.1醇类化合物

果酒的香气物质主要由酵母发酵产生的酯类和高级醇综合作用产生，是一个重要的质量指标，使用添加麦芽汁的培养基有增加不良香气的风险，需要进行检测评价[11]。对使用不同活化培养基酵母发酵原酒的香气物质使用气质色谱分析发现，含有麦芽汁的M1至M4培养基相对于参照的YEPD培养基，产生的高级醇含量均显著降低约10%，而处理组M1-M4之间高级醇含量差异不显著。

高级醇含量过高容易造成酒体香气过浓，产生不良味感，是果酒的主要异杂味来源之一[13]。蓝莓酒中的醇类主要来源于酒精发酵、氨基酸转化及有机酸降解物的氧化。当缺乏氮或者氨基氮会促使酵母细胞转向利用来自氨基酸的氮源，从而留下了转氨的高级醇，处理组的酵母菌对氮源利用率升高，相当于增加了氮源，能够降低高级醇的生成量。可能是由于酵母利用麦芽糖需要通过质子输送系统输送，限制了麦芽汁的大量利用，因而彼此差异不显著（＜0.05）[14]。

2.2.2酯类化合物

酯类物质可丰富蓝莓酒香气，增加风味品质的感知强度[11]。从图3可以看出，M2活化的酵母产酯类含量最高，质量分数达到48.2%，显著高于YEPD组的36.1%，说明麦芽汁起到促进作用。随着培养基中麦芽汁浓度升高，M3，M4中酯类含量并未显著高于M1和YEPD的活化组。

图3　蓝莓酒中主要香气物质Fig.3 The main flavour materials in Buleberryfruit

酯类化合物是蓝莓酒中重要的香气成分物质之一，在发酵过程中由酵母形成，其途径有两条：一条是在酯酶的催化下由氨基酸的碳源骨架产生，另一条是乙酰辅酶A在醇酰基转移酶的作用下酵解生成[15]。

图4　酯类合成途径Fig.4 The route of synthesis of acetate esters

由图4看出，单糖能够通过EMP途径在NAD和酶的作用下生成乙酰辅酶(CH3COSCOA)，进一步在酶和醇类的参与下反应生成乙酸酯类等酯类。酯类合成需要泛酸，当蓝莓果浆中氮源含量很低时，作为酯类前体物质的氨基酸碳源骨架含量也会减少，从而使得酯类生成量减少。实验中差异主要产生于发酵过程，这主要是由于酵母菌生命活动差别所致。

3　结论

1）实验进一步论证了酵母活化是果酒酿造过程中一个关键步骤，其中培养基的营养成分会影响酵母菌的成活率和生长状态，而酵母菌的生长代谢状况会对果酒的酒度、残糖以及构成香气物质的主要成分高级醇和酯类物质含量等产生影响。使用麦芽汁和蓝莓果肉优化后的活化培养基能够促进蓝莓酒质量的提升。

2）活化培养基中麦芽汁浓度的升高能够在一定程度上促进酵母的生长和活化，提高对糖类等物质的利用率和酯类物质含量，保持高级醇处于较低水平，使香气物质更加浓郁。但麦芽汁含量超过3%时，促进效果不显著。因此从生产成本和使用效果综合考虑，在蓝莓果酒生产中，建议使用质量分数为3%的麦芽汁培养基进行酵母活化。此外，对于其他品质如颜色、口感以及香气物质的评价还需要进一步研究。

参考文献：

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Effect of Medium on Yeast Growth and Quality of Buleberry Wine

HUO Yu-xiaSA Yu-long
(Hulunbeier Vocational Technical College,Neimenggu 021000,China)

Abstract:The blueberry fruit pulp and malt extract were selected to study the effect of medium on the growth of active dry yeast(ADY)and the quality of blueberry fruit wine,comparing to ADY extract peptone dextrose(YEPD)medium.The results indicated that the activation of ADY could significantly influenced by the content of glucose and yeast extract,and the activation improved by adding blueberry fruit pulp,malt extract and glucose reach better result than the control (YEPD).The ADY could quickly grow and propagate,with low dead cell ratio;the blueberry fruit wine reduced residual sugar and high alcohol,whereas raised the content of esters by 12.1%,with full aroma.The activating effect of medium had not heightened with a rise malt extract after the concentration of malt extract higher than 3%.The improved medium could not only supplied ADY with necessary nutrition but also raise the utilization rate of the sugar,amino acid and so on, helping the tasting and aroma of buleberryfruit wine more balance.

Key words:Active dry yeast；activating medium；selection,blueberry fruit wine；quality

中图分类号：TS261.4

文献标志码：A

文章编号：1008-1038(2016)04-0018-05

收稿日期：2015-12-16

基金项目：呼伦贝尔职业技术学院院级课题(课题编号：15-HZY12)

作者简介：霍雨霞(1984—)，女，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术