密度梯度离心方式对人工授精结局的影响

朱立华 肖新燕 许玉刚 孙秀芬

山东省聊城市第二人民医院生殖内分泌科（临清　252600）



密度梯度离心方式对人工授精结局的影响

朱立华 肖新燕 许玉刚 孙秀芬

山东省聊城市第二人民医院生殖内分泌科（临清252600）

摘要目的 探讨精液经密度梯度离心时经水平转子和角转子处理后对精液质量及其对人工授精结局的影响。方法 回顾性分析352个人工授精周期，根据梯度离心时转子的不同，分成水平转子组和角转子组两组，精液经密度梯度离心法处理，形态学分析严格按照WHO（World Health Organization）人类精液检验与处理实验手册第五版标准，比较处理后精液质量及两组对妊娠结局的影响。结果 （1）精液质量比较：水平转子组前向运动精子为（89.2±8.5）%、精子浓度为（47.8±14.3）×106/mL、前向运动精子总数为（13.6±6.3）×106；角转子组前向运动精子为（90.1±8.8）%、精子浓度为（43.4±15.1）×106/mL、前向运动精子总数为（12.9±6.1）×106，无统计学差异 （P＞0. 05）。水平转子组和角转子组正常精子比率分别为（18.5±8.2）%和 （14.2±5.7） %，两者存在显著性差异（P＜0.05）；（2）妊娠结局比较：水平转子组的临床妊娠率为16.5%（30/182）、流产率为 3.3%（1/30）、活产率为 96.7%（29/30）；角转子组生化妊娠率为临床妊娠率为12.4%（21/170）、流产率为 9.5%（2/21）、活产率为 90.5%（19/21），无统计学差异（P＞0. 05），生化妊娠率：两组分别为 0%（0/30），19.2%（5/26），有统计学意义（P＜0.05）。结论 密度梯度离心应用水平转子可以降低对处理后精液的精子形态的影响，减少生化妊娠率。

关键词授精， 人工； 离心法， 梯密度； 妊娠结局

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.004

夫精宫腔内人工授精（intrauterine insemination，IUI）是一种简单便捷的辅助生殖技术，对男性不育因素，女性宫颈因素、免疫因素及不明原因的不孕症治疗有较好疗效，但是由于受到夫妇双方各种因素的影响其妊娠率一直偏低，文献报道成功率仅为5%～15%［1， 2］；精液优选方法在对精子优化过程中，同时影响精子的畸形率，DNA的完整性［3］等，进而影响人工授精结局。本文旨在分析梯度离心时运用角转子和水平转子处理精液对人工授精结局的影响。

资料与方法

一、一般资料

回顾性分析2011年7月至2014年7月聊城市第二人民医院生殖医学科的352个IUI 周期的临床资料。所有入选病例至少有一侧输卵管通畅， 各周期不孕妇女HCG注射日子宫内膜均为A型（“三线征”）。梯度离心时采用角转子共 182 个周期；梯度离心时采用水平转子共170 个周期。

二、方法

（一）精液分析及处理

男方禁欲3～7d，手淫法采集于广口无菌无毒容器中，置室温充分液化30min，记录精液量、液化时间，使用伟力精子检测系统检测精子浓度、活动率、a+b级精子比例。采用密度梯度离心法分离精子，将液化后的精液充分混匀加于平衡好的90%、45%的梯度液上层，放入离心机300×g，离心20 min后弃上清，加入1 mL精液清洗液（SAGE-1005）后混匀，300×g，离心20 min，弃上清，沉渣加入0.4～0.5 mL HTF液，置5% CO2培养箱备用于人工授精。

（二）精子形态学分析

精子原液及人工授精备用液于清洁的载玻片上，分别均匀涂片两片后待其自然干燥，改良巴氏染色，干燥后立即显微镜观察，精子形态分析按照WHO人类精液检验与处理实验手册第五版标准；患者的两张涂片各观察评估至少200个精子，计算两次评估正常精子比例均值和误差，确定误差在可接受的范围之内（95%可信区间），计算两次结果平均值。使用伟力精子检测系统检测精子浓度、前向运动精子率并根据精液体积计算前向运动精子总数。

（三）治疗方案及卵泡监测

1. 自然周期（natural cycle， NC）：周期第10天起B超监测卵泡发育，至优势卵泡直径达14 mm 时开始监测尿黄体生成素（luteinizing hormone， LH）峰，出现LH 峰后24h～40 h 左右行IUI。

2. 人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotrophin， HMG）促排卵周期：从月经第5 天开始用药，75 u/d，连用5 d 后根据卵泡发育情况增减剂量，卵泡直径达18 mm 时肌肉注射5000u～10000u，注射HCG 24h～36 h 后行IUI。

3. FSH+HMG：从月经第5天开始用药， 丽申宝75 u/d，连用5 d 后，卵泡直径达12mm～13 mm时加用HMG75 u/d，并调节用量至成熟，注射HCG 24h～36 h后行IUI。

4. LE +HMG：月经周期第五天服用来曲唑片（2.5mg/片，北京诺华公司）5mg/ qd×5d，B超监测卵泡大小，接着加用HMG（75u/支）1支/d，根据卵泡大小调整用量直至成熟，注射HCG 24h～36h 后行IUI。

（四）手术方法

受者取膀胱截石位，暴露宫颈后，用1 mL的注射器与特制的无损伤导管连接，吸取经处理后的精子悬液0.3～0.5 mL，将导管轻轻插入宫颈内口，于2～3 min内将精子悬液注入后， 缓慢取出导管， 臀高位仰卧30 min。

（五）黄体支持

对受术者均行黄体支持，使增生期子宫内膜向分泌期转化，于确定排卵日每日肌注黄体酮40 mg，共 15 d。

（六）临床妊娠及生化妊娠的判定

通过对尿妊娠免疫试验或血β- HCG 检测确定妊娠者进行随访。3周后复查B 超， 检测到孕囊、卵黄囊及心脏搏动者确定为临床妊娠。3周后复查B 超，监测不到孕囊、卵黄囊及心脏搏动者确定为生化妊娠。

三、统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件进行数据的统计分析，均数的比较采用方差分析，率的差异性分析采用x2检验，P＜0. 05为差异有统计学意义。

结　 果

一、水平转子组与角转子组患者配偶一般资料比较

梯度离心水平转子组与角转子组患者资料对比无显著性差异 （P＞0.05），见表1。

二、水平转子组与角转子组患者促排卵方式和不孕原因比较

梯度离心水平转子组与角转子组患者促排卵方式和不孕原因对比无显著性差异 （P＞0.05），见表2。

三、水平转子组与角转子组梯度离心前后精液参数比较

处理后水平转子组和角转子组正常精子比率分别为（18.5±8.2）%和（14.2±5.7 ）%，两者存在显著性差异（P＜0.05），见表3。

四、水平转子组与角转子组妊娠结局比较

IUI后，对患者妊娠结局进行随访，水平转子组和角转子组生化妊娠率分别为0%（0/30）和 19.2% （5/26），两者存在显著性差异（P＜0.05），见表4。

表1　水平转子组与角转子组患者配偶一般资料比较

表2　水平转子组与角转子组患者促排卵方式和不孕原因比较

表3　水平转子组与角转子组梯度离心前后精液质量比较

表4　水平转子组与角转子组妊娠结局比较

讨　 论

近年来，诱发排卵药物的改进、精子优化技术的提高、处理液的更新等，使人工授精的临床应用有了很大的进步。IUI技术是将精液经实验室处理后，在排卵期注入患者宫腔内以获得较高的临床妊娠率。作为人类辅助生殖的关键技术之一，精子优选技术直接关系到整个辅助生殖治疗的成败。人工授精影响因素的研究集中在男性精液质量参数，如前向运动精子比率、前向运动精子总数［4］、精子浓度［5］及正常形态精子比率［6-9］；女性因素则认为女性患者年龄［10］、不孕年限、卵泡数目、子宫内膜厚度 、HCG日激素水平、BMI［11-14］等因素和人工授精临床妊娠率密切相关。

目前，精液优化处理方法主要有上游法、密度梯度心法［15］和直接离心法 ，精液优化的目的是回收大量的前向运动精子或者具有正常形态精子。密度梯度离心法因其具有高回收率的特点，在辅助生殖实验室的精液优化中大量应用。精子DNA结构的完整性，不但是提高的妊娠率的因素［16］，而且与优生优育也具有十分密切的关系。有人将离心法处理后的精子进行精液质量及DNA完整性检测，结果表明精子形态、活力、活率、各种运动参数较优选前均有所提高或加强，但离心法处理后的精子，其DNA损伤率较优选前还要高，这表明离心法可对精子DNA结构造成损伤［17］。

本研究中所有周期均采用密度梯度离心法对精液进行优化处理，根据使用转子的不同随机分为水平转子组及角转子组。并对两组患者的基础资料包括：年龄（岁）、不孕年限（年）、卵泡数目（n）、子宫内膜厚度（mm）、 HCG日激素水平、BMI（kg/m2）以及促排方案和不孕原因等在过去研究中认为和人工授精密切相关的女性患者的资料进行比较，结果无显著差异（P＞0.05）；对可以影响妊娠率的促排方案和不孕原因进行比较，两组之间无统计学差异（P＞0.05）；对处理前后精液中公认的影响人工授精的参数进行比较发现：处理前两组患者配偶精液质量：前向运动精子比率（%）、精子密度（106/mL）、前向运动精子总数（×106）、正常形态精子比率（%），无显著差异（P＞0.05）处理后：前向运动精子比率（%）、精子密度（106/mL）、前向运动精子总数（×106）无显著差异（P＞0.05），但是两组正常形态精子比率差异显著，有统计学意义（P＜0.05），这说明水平转子的离心过程对精子形态的影响要比角转子小，可以回收更多的正常形态的精子；对公认的可以影响妊娠率的促排方案和不孕原因进行比较，两组之间无统计学差异（P＞0. 05）。

人工授精后对妊娠结局随访的结果可以看出，两组在流产率、临床妊娠率、活产率的比较无差异，然而生化妊娠率角转子组却显著高于水平转子组，通过本研究推测可能是在离心过程中角转子较大程度地影响了精子的形态和精子DNA的完整性，致使较水平转子富集正常形态和具有完整DNA的精子比率低，进而造成生化妊娠率的提高，这有待于进一步的实验证实。由此我们可以得出结论：密度梯度离心法可以富集大量的前向运动和正常形态的精子，从而达到精子优化的目的；在离心过程中应用水平转子可以提高处理后精子的正常形态比例，降低生化妊娠率的发生。

参 考 文 献

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（2015-09-07收稿）

中图分类号R 321-33

The infl uence of density gradient centrifugation with different mode on the outcome of intrarauterine insemination

Zhu Lihua， Xiao Xinyan， Xu Yugang， Sun Xiufen Productive Medical Department of the 2nd Hospital of Liaocheng ， Linqing 252600， Shandong， China

AbstractObjectiveTo assess the infl uence of density gradient centrifugation with swing-out rotors and fi xed-angle rotors on sperm quality， and the outcomes of intrarauterine insemination（IUI）. Metthhooddss352 IUI cycles were retrospectively analyzed in the study. Semen samples were processed with density gradient centrifugation， and were divided into swing-out rotors group and fi xed-angle rotors group based on different rotors. Sperm quality and morphology were analyzed strictly according to the fi fth edition of the World Health Organization laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sperm quality and outcomes of IUI were comparatively analyzed between the two groups. Ressuullttss（1）Sperm quality∶ There were no signifi cant differences between two groups in the percent of progressive motility sperm， sperm density， the total number of progresive sperm （89.2±8.5）%， （47.8±14.3）×106/mL， （12.9±6.1）×106in swing-out rotors group and （90.1±8.8）%， （43.4±15.1）×106/mL， （12.9±6.1）×106in fi xed-angle rotors group， P＞0.05）， but there was a signifi cant difference in the percent of normal morphology sperm between the two groups（18.5±8.2）% and （14.2±5.7） %， P＜0.05. （2） Outcomes of IUI. There were no signifi cant differences between the two groups in clinical pregnancy rate， abort ratio and live birth rate （16.5%（30/182）， 3.3%（1/30）， 96.7%（29/30） in swing-out rotors group and 12.4%（21/170）， 9.5%（2/21），90.5%（19/21） in fixed-angle rotors group； P＞0.05） . But there was a significant difference in biochemical pregnancy rate 0%（ 0/30） in swing-out rotors group， 19.2%（5/26） in fi xed-angle rotors group； P＜0.05. ConcluussiioonnDensity gradientcentrifugation with swing-out rotors could reduce the infl uence to sperm normal morphology and decrease the biochemical pregnancy rate.

Key wordsinsemination， artifi cial； centrifugation， density gradient；pregnancy outcome