体液检测在结直肠癌中应用的研究进展

邢宝才 刘伟



体液检测在结直肠癌中应用的研究进展

邢宝才 刘伟

邢宝才 教授、主任医师、博士生导师。北京大学肿瘤医院肝胆外一科主任，外科教研室主任。从事肿瘤外科的临床与研究近三十年，主要的研究领域是结直肠癌肝转移，原发性肝癌的外科治疗。对结直肠癌肝转移的外科手术与围手术期的治疗有较高的造诣。目前担任着中华外科学会肝脏外科学组委员、中国抗癌协会肝癌专业委员会常委、中国抗癌协会大肠癌委员会肝转移学组委员、中国医师协会外科分会MDT专委会副主任委员、中国医师协会外科分会肝脏外科委员会常委、中国医促会肝脏外科分会副主任委员、中国医促会结直肠癌肝转移分会常委。担任《中华肝胆外科杂志》等多个杂志的编委。

【摘要】体液检测是指以血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测，包括了循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA 两大类。能帮助实时动态监测肿瘤原发灶及转移复发灶基因组信息，协助早期诊断、疗效监测、预后判断，也有助于靶向治疗适应症的评估，从而推进精准医疗的实施。液态活检属于新型的无创性分子病理检测方式。在结直肠癌诊疗领域具有广阔的临床应用前景，也是推动肿瘤基础研究进展的重要助力。

【关键词】结直肠肿瘤； 治疗应用； 体液检测； 循环肿瘤细胞，循环肿瘤DNA

作者单位：100142 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所肝胆胰外一科， 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室

结直肠癌在我国发病率居所有恶性肿瘤中第五位。2015年我国新发病例376300，死亡率191，000［1］。其中，50%结直肠癌患者会发生肝转移［2-3］。通过多学科治疗，结直肠癌肝转移5年生存率和10年生存率可达到50%和20%［4-5］。然而，目前现有的肿瘤标志物在预测复发和转移方面并不尽如人意，其存在滞后性且灵敏度和特异度都较低。因此，结直肠癌研究的一个重要目标就是找到可以方便准确预测复发和转移的生物标记物。随着对结直肠癌肝转移的深入研究，对于手术后切除预后预测，疗效评估及复发监测，体液检测在结直肠癌肝转移中逐渐进入更为广泛的研究。其主要指血液中包含的两种可以用于分析肿瘤分子表型的物质，即循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）和循环肿瘤DNA（circulating tumor，ctDNA）。

循环肿瘤细胞是指能在肿瘤患者外周血中检测到、来源于实体肿瘤、逃离宿主免疫杀伤后存活的异质性肿瘤细胞［6］。进入血液循环而未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶［7］。CTC以单个细胞或细胞团（又称循环肿瘤微栓子，CTM）存在于循环系统中。研究发现CTC的形成与上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）机制有关［8］。血液中的CTC 既可能是直接从病灶脱落进入血液中的上皮特征CTC，也可能是经历EMT由原发灶或转移灶脱落进入并生存于血液循环中的CTC。最新研究发现，CTM与间质细胞表型CTC密切相关，并且高比例的间质细胞表型CTC与化学治疗耐药有关［9］。

循环肿瘤DNA是一类源于肿瘤细胞的双链DNA片段，大小在0.18～21 kb之间，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等液体中，可经尿液和粪便排出，含量极微。ctDNA的发现可追溯至对循环游离DNA（cell-free circulatingDNA，cfDNA）的早期研究中。cfDNA是由机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。1977年Leon等发现肿瘤患者外周血中cfDNA浓度较正常人显著升高，且具有肿瘤细胞的基因组特征［10-11］。通过对cfDNA中肿瘤特异性的畸变（如肿瘤原癌基因和致癌基因突变、微卫星改变和DNA甲基化等）的识别，证实其为肿瘤细胞来源的cfDNA，即ctDNA，且与肿瘤细胞基因组信息相一致［11］。ctDNA主要来源于：1.坏死的肿瘤细胞；2.凋亡的肿瘤细胞；3.肿瘤细胞的外排体。

一、常用检测技术

（一）CTCs分离、富集相关技术

1.免疫磁珠富集法（immunomagnetic beadsseparation，IMS）

IMS技术基于细胞表面的抗原与连有特异性抗体的磁珠相结合，并在外源磁场的作用下富集细胞，其根据分离的策略可以分为阳性富集法和阴性富集法两大类。阳性富集法是指磁珠结合得到的细胞就是所需要的细胞。目前唯一已获得美国食品药品监督局批准上市的循环肿瘤细胞检测试剂盒就是针对细胞表面的上皮细胞粘附分子来分离CTCs。根据CTCs的含量与临床预后的关联其他还在研究阶段的磁珠包被标记物如广谱标记物（全角蛋白）和其他肿瘤类型相关标记物如CerBb2、Mucin、AFP等。此外，用于分离CTCs的标记物除了蛋白质类标记物，还包括了mRNA 和端粒酶类的标记物，提高了CTCs的检出效率［12］。阴性富集法是指磁珠结合得到的细胞不是所需要的细胞，主要应用了针对白细胞的广谱标记物CD45，在磁场作用中剔除了有核细胞游中的白细胞，其中未被结合的细胞就是所需要的CTCs，能大大增加CTCs 的检出数量［13］。

2.CTCs芯片技术

第一代CTCs芯片是基于微流体学原理，以微阵距的方式将针对CTCs细胞表面标记物（EpCAM）的抗体包被在芯片上，当血液样本通过芯片时，就能通过抗体将其中的CTCs细胞捕获下来。第二代芯片根据微流体涡流原理设计了弯道型的内槽，增加了细胞与包被抗体时间的接触时间，显著提高了CTCs的获取效率［14］。可以在芯片上还能进行各种原位检测，如苏木素-伊红染色、免疫荧光染色等，透过芯片通过显微镜能直观地观察CTCs的形态学特征和染色结果。

3.滤过膜分离法（filter membrane filtration，FMF）

FMF技术基于CTCs 的细胞体积显著大于白细胞的原理，采用一定孔径的滤过膜将CTCs从血液中分离出来，也被称为膜滤过分离肿瘤细胞技术（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET），每毫升血液中可以提取到至少1个肿瘤细胞［15］。由于ISET法分离CTCs主要基于细胞的体积而不是细胞表面的相关抗原，因此主要适用于异质性明显的恶性肿瘤如肺癌、胃癌和前列腺癌等，大大降低了由于抗原交叉表达或差异表达而导致的假阳性率［16］。

（二）ctDNA分离及检测技术

ctDNA由于片段较小、含量很少，而且容易和血浆蛋白相结合，因而常规的提取效率都不高。针对血浆中ctDNA的抽提原理主要有四大类：盐析法、酚-氯仿抽提法、微柱吸附法和磁珠吸附法。而传统的盐析法和酚-氯仿法由于操作步骤复杂、需要使用有机溶剂、ctDNA的提取效率较低。通过比较各类试剂盒发现，磁珠法获得的ctDNA在质量和含量上都要优于微柱吸附法，假阳性率也较低。ctDNA检测技术根据检测目的来选择相应的技术方法，其中大部分是以PCR技术为基础，如实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR等，也有基于微珠富集原理的方法［17］。目前，ctDNA检测技术已经广泛地应用于K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等肿瘤靶向治疗、诊断及预后相关标记的检测。

二、临床应用

（一）判断预后

CTC可以预测患者预后。一项荟萃研究发现，当CTC＞3个/7.5 mL，则结直肠癌的5年生存率较低，治疗效果也较差；但如果治疗后CTC水平可下降（＜3个/7.5 mL），则预后较好［18］。该研究表明，CTC数量的多少与结直肠癌患者远处转移以及预后关系密切，可用于判断结直肠癌患者预后。同时，Cohen等人发现，CTC≥2个是结直肠癌肝转移患者的不良预后因素（HR：2.78，95%CI：1.10～7.02），并且与围手术期死亡率相关。结直肠癌肝转移患者CTC平均数目普遍多于无转移的患者，而且可切除的结直肠癌肝转移患者CTC阳性率远低于不可切除患者［19］。

（二）疗效评估

随着肿瘤药物多样化的出现，如何选择安全可靠的疗效评估手段以验证新的治疗方法的有效性，是肿瘤治疗过程中所面临的重要挑战。目前临床常用的疗效监测方法，包括血清学指标和影像学检查均存在诸多不足。体液检测能否成为疗效评估的手段，已经引起越来越多的注意。ctDNA作为一种新的生物标志物，可满足临床实时、动态、无创监测肿瘤负荷变化的要求。Tie等人发现，术前化疗的结直肠癌肝转移患者，ctDNA水平可以在化疗2周期后发生显著下降；而相应的CT检查则需要化疗开始后的8～10周时才能进行评价。同时，ctDNA水平降低10倍以上时，肝切除术后无病生存时间明显延长。CTC计数不仅在晚期肿瘤患者的预后评估方面具有意义，其治疗前后的数目变化，也可在一定程度上反映疗效，可能在疗效监测方面具有意义。Nole等研究显示，治疗前CTC超出5个/7.5 mL的转移性乳腺癌患者，约一半患者的CTC数目可在治疗中降低［20］。若CTC数目无变化或增高，则提示治疗无效。

（三）复发监测

目前，术后或放疗后，体液检测能否根据分子水平证据判断复发仍旧存在争议。患者外周血中已经有肿瘤细胞的存在。虽然，大部分肿瘤细胞被免疫系统吞噬，但是在适当的条件下能进一步发展成新的肿瘤灶。早期研究通过RT-PCR方法，发现未接受相关治疗的患者已知的转录因子发生活化，是复发的前期表现［21］。观察结直肠癌患者术后2～5年ctDNA的情况，结果显示术后检测到ctDNA的患者病情复发，而阴性的患者没有复发［22］。因此ctDNA是切除后残留病灶的潜在标志物。ctDNA应在手术后（在一般情况下，手术后6～8周）辅助治疗之前进行检测，以得到最佳的治疗决策。不过，某些情况下cfDNA浓度低于检出突变的最佳量，所以使用ctDNA 作为诊断癌症和检测微小残留病灶时需要高度特异性的标记物及更灵敏的分析技术。

（四）靶向药物治疗的耐药性监测

CTCs对晚期肿瘤患者进行预后判断以及疗效监测的意义，都是基于其数目的变化。而CTCs的另一项潜在临床价值是基于其分子改变确定靶向药物的耐药性监测。有文献报道，可在转移性结肠癌患者的CTCs中检测到KRAS基因的突变［23］，并且30%接受靶向药物治疗的患者会发生继发性KRAS基因突变。提示通过跟踪检测外周血中CTCs的分子改变，可以作为靶向药停用的依据。尤其是针对不易获得肿瘤组织的晚期转移性肿瘤患者，在使用靶向药物治疗前，通过检测肿瘤组织和（或）CTCs的分子改变来选择靶向药物；在靶向药物治疗过程中，通过动态监测CTCs的分子改变，来判断靶向药物治疗的终点。分子改变早于影像学改变，从而提示临床医生对治疗过程的早期干预、降低不必要的费用、减轻患者遭受的不良反应。

（五）肿瘤负荷

结直肠癌肝转移患者常规评价肿瘤负荷的方法仅局限于影像学检查。对于术前化疗患者的有效性评价，也仅仅依靠RECIST标准。体液检测的出现，能够确切评价肝脏肿瘤负荷。Kaifi通过回顾性分析24例结直肠癌肝转移患者发现，当CTC≥3个/ 7.5 mL时，肿瘤/肝体积比＞30%；并且CTC数目与血中CEA水平保持高度一致性［24］。

综上，相较于传统的组织活检或固相活检，体液检测的优势十分明显。由于样本来源是体液，尤其是血液，临床获得样本途径非常简便，可以做到随时取样、随时监测，但是液态活检有一定的局限性。

参 考 文 献

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（本文编辑：杨明）

邢宝才,刘伟. 体液检测在结直肠癌中应用的研究进展[J/CD].中华结直肠疾病电子杂志, 2016, 5(2): 110-113.

•述评•

The advances of the liquid biopsy in colorectal cancer

Xing Baocai, Liu Wei. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research, Ministry of Education, Peking University School of Oncology, Beijing Cancer Hospital and Institute, Beijing 100142, China Corresponding author: Xing Baocai, Email: xingbaocai88@sina.com

【Abstract】Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or circulating tumor DNA that mainly exist in the bloodstream and other body fluid. Liquid biopsy is a novel kind of non-invasive technique and has a wide prospect of clinical application in the molecular pathological field. This review presents the advances of liquid biopsy and its clinical application values in the field of colorectal cancer, including prognosis assessment, early cancer screening and prediction of treatment responses.

【Key words】Colorectal neoplasms; Therapeutic uses; Liquid biopsy; CTC; ctDNA

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.02.01

基金项目：国家自然科学基金（81371868）

通信作者：邢宝才，Email：xingbaocai88@sina.com

收稿日期：（2016-3-26）