姜黄素类似物L6H4对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用*

应丽丽，　倪瑾瑶，　李慧敏，　余　霞，　陈　霖，　陈三妹，　陈国荣△

(1温州医科大学附属第一医院病理科，浙江 温州 325015; 2绍兴文理学院医学院，浙江 绍兴 312000)

姜黄素类似物L6H4对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用*

应丽丽1，倪瑾瑶1，李慧敏1，余霞1，陈霖1，陈三妹2△，陈国荣1△

(1温州医科大学附属第一医院病理科，浙江 温州 325015;2绍兴文理学院医学院，浙江 绍兴 312000)

[摘要]目的： 探讨姜黄素类似物L6H4对2型糖尿病心肌病大鼠的保护作用及机制。方法: 雄性SD大鼠40只，随机均分为正常对照(NC)组、高脂(HF)组、高脂治疗(FT)组、糖尿病(DM)组和糖尿病治疗(DT)组。采用高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病模型，用L6H4治疗8周。生化法测血糖及血脂水平，ELISA法测血清脂联素(APN)水平，放射免疫法测大鼠血清胰岛素水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，Masson染色和电镜观察心肌形态改变，免疫组化测心肌脂联素受体1 (AdipoR1)及转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白的表达。Western blot法检测大鼠心肌内AdipoR1蛋白表达量。结果: HF组及DM组大鼠血糖、血脂、胰岛素、HOMA-IR及TGF-β1蛋白水平较NC组均有升高，L6H4治疗后均下降；HF组及DM组大鼠血清APN水平及心肌AdipoR1较NC组均有下降，L6H4治疗后均升高。DM组和HF组大鼠心肌纤维化，线粒体肿胀，嵴紊乱，部分消失，经L6H4干预后，大鼠心肌的形态学损害明显减轻。结论: L6H4对2型糖尿病大鼠的心肌具有保护作用；血清APN浓度增加，心肌AdipoR1蛋白表达增强，及APN抑制TGF-β1的表达可能参与其中。

[关键词]糖尿病； 心肌； 姜黄素类似物L6H4； 脂联素； 脂联素受体1； 转化生长因子β1

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是2型糖尿病患者死亡的重要原因。DCM发病机制尚不明确，可能的机制包括心肌纤维化、胰岛素抵抗、高血糖诱导的代谢紊乱等，其特征性病变之一为心肌纤维化。已有研究表明脂联素(adiponectin，APN)是一种由脂肪细胞分泌的具有抗炎、抗动脉粥样硬化以及胰岛素增敏效应的细胞因子；转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是一种重要的致纤维化因子，与各脏器的纤维化密切相关。L6H4已被证实具有抗炎、降血糖、抗氧化等广泛药理作用，但目前关于L6H4在防治糖尿病心肌病的研究鲜有报道。本实验通过研究L6H4对高脂血症及糖尿病大鼠APN、脂联素受体1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)及TGF-β1的影响和机制，为糖尿病心肌病的防治提供理论依据。

材料和方法

1动物分组与处理

SPF级雄性SD大鼠40只(购自温州医科大学实验动物中心)，体重180～220 g，随机均分为5组：正常对照(normal control，NC)组、高脂(high-fat，HF)组、高脂治疗(high-fat treatment，FT)组、糖尿病(diabetes mellitus，DM)组和糖尿病治疗(diabetes treatment，DT)组，后4组高糖高脂饲养[1](饲料配方含10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐和66.5%常规饲料)。喂养4周以后，DM组及DT组禁食12 h后按30 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素诱导2型糖尿病，72 h及 1 周后检测尾静脉空腹血糖，血糖值>16.7 mmol/L为造模成功，NC组、HF组和FT组腹腔注射等容积枸橼酸缓冲液。造模成功后，后4组继续高脂喂养，FT组及DT组用0.2 mg· kg-1· d-1姜黄素类似物L6H4溶于1%羧甲基纤维素钠灌胃，其余组别按同等剂量羧甲基纤维素钠灌胃，每天1次，并每日称重，持续8周。

2药品与主要试剂

姜黄素类似物 L6H4为温州医科大学药学院梁广教授惠赠。血清脂联素ELISA试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司；胰岛素放免试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司；兔抗鼠AdiopR1单克隆抗体购于Abcam；兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体和山羊抗兔单克隆抗体(II抗)PV6001均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

3实验方法

3.1血糖、血脂等相关指标的检测第12周末，禁食12 h后，股动脉放血处死大鼠，收集血清。微量血糖仪测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)值，全自动生化分析仪检测各组大鼠甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。ELISA测定空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)水平，并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。双抗体夹心ABC-ELISA法测血清APN水平。

3.2标本处理及光镜标本制备SD大鼠处死后，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干水分后称重并计算心指数。心脏重量指数=心脏重量(mg)/体重(g)。取部分左心室肌以4%甲醛固定用于常规切片。为了观察心肌间质胶原纤维分布情况行Masson染色，按文献[2]方法进行。

3.3免疫组化实验检测AdipoR1及TGF-β1蛋白的表达情况，AdipoR1抗体和TGF-β1抗体按1∶100浓度稀释，采用EnVision二步法，并随机选择10个高倍镜视野(×400)，通过图像分析系统计算蛋白平均吸光度值(A值)。

3.4电镜标本制备具体步骤参见参考文献[3]。

3.5Western blot 实验提取左心室心肌组织总蛋白，用Bradford法检测蛋白含量。取50 μg蛋白，电转移到硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶室温封闭1 h。加入 I 抗AdipoR1(1∶1 000)4 ℃过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。以GAPDH抗体作为内参照,用Bio-Rad Quantity One 4.6凝胶成像分析系统拍照，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对各条带进行相对定量分析。

4统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，数据均为正态分布，以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及相关性分析，各组均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1一般情况

在整个实验过程中，NC组及高脂实验组大鼠饮食、饮水、活动及大小便情况均正常，毛发光泽顺滑；DM组大鼠体重减轻，行动迟缓，毛发失去光泽、干燥、色黄，精神萎靡；经L6H4干预后，DT组大鼠一般情况较DM组明显好转。

2体重及心脏指数

分组前各组体重差异无统计学意义，实验结束时，与NC组相比，DM组体重明显减轻(P<0.01)；经L6H4治疗8周后， DT组体重增加(P<0.01)。实验结束后，DM组大鼠心脏重量指数与正常组相比明显增高(P<0.01)；L6H4干预后，DT组心脏重量指数明显下降(P<0.01)，见表1。

表1各组大鼠体重及心脏重量指数比较

Table 1.Comparison of the body weight and the heart index of the rats with different treatments (Mean±SD.n=8)

Group Bodyweight (g) Heartweight (mg)Heartindex(mg/g)NC362.25±18.621166.25±62.783.22±0.15HF418.88±24.90**1457.50±198.04*3.47±0.37FT351.75±19.68##1122.50±102.92#3.19±0.25DM245.13±9.00**1050.00±29.76**4.29±0.07**DT309.25±13.95△△1203.75±42.74△△3.89±0.08△△

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3各组FBG、FINS、HOMA-IR、血脂和APN的检测

3.1各组FBG、FINS及HOMA-IR检测实验结束时，与NC组相比，HF组及DM组大鼠FBG、FINS及HOMA-IR均有不同程度增高，经L6H4干预后，FT组及DT组的上述指标均下降，提示姜黄素类似物L6H4具有降低血糖及增加胰岛素敏感性的作用，见表2。

表2各组血糖、血脂及胰岛素抵抗指数的比较

Table 2.The changes of FBG, FINS and HOMA-IR in the rats with different treatment (Mean±SD.n=8)

GroupFBG(mmol/L)FINS(mIU/L)HOMA-IRNC6.73±0.5117.54±3.165.26±1.13HF10.61±1.04**23.07±4.23**10.86±2.17**FT7.66±0.66##19.98±3.286.81±1.31##DM30.47±1.82**31.14±1.89**42.07±1.85**DT13.73±1.15△△25.00±1.94△△15.20±1.06△△

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3.2各组大鼠血脂水平的比较实验结束时，HF组及DM组大鼠血清中TG、TC的浓度及LDL-C/HDL-C值较NC组均显著升高(P<0.01)，经L6H4治疗后，FT组及DT组上述指标均有下降(P<0.01)，提示L6H4有降脂作用，见表3。

表3　各组大鼠血脂的比较

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3.3血清APN水平检测及血清APN水平与FBG、FINS、HOMA-IR、血脂水平相关性分析实验结束时，HF组及DM组血清APN水平与NC组相比明显降低(P<0.01)；DM组病变更严重，经L6H4治疗后，FT组血清的APN水平上升，但差异无统计学意义；DT组血清的APN水平明显上升(P<0.01)，见图1。相关分析表明，大鼠血清的APN水平与FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC及LDL-C/HDL-C水平均呈负相关(相关系数分别为-0.656、-0.556、-0.627、-0.728、-0.820和-0.664，P<0.01)，提示血清APN水平与糖尿病糖脂代谢及胰岛素抵抗密切关系。

4Masson染色观察心肌改变

心肌Masson染色光镜显示，NC组及FT组大鼠心肌肌束排列整齐，血管壁周围及心外膜仅见少量胶原纤维分布，其余部位未见明显沉积；HF组大鼠心肌肌纤维排列尚整齐，血管壁周围及间质见较多量胶原纤维沉积(P<0.01)；DM组肌纤维排列紊乱，心肌间质见大量亮绿色胶原纤维沉着(P<0.01)；L6H4治疗后，HF组和DT组心肌的上述病变明显减轻(P<0.01)，见图2。

Figure 1.Comparison of the serum concentrations of APN in the rats with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC;##P<0.05vsDM.

图1各组血清脂联素水平的比较

5心肌AdipoR1与TGF-β1的表达情况及其相关性分析

免疫组化结果显示，NC组大鼠心肌AdipoR1呈弥漫强阳性表达，HF组阳性表达较NC组下降(P<0.01),DM组蛋白表达强度明显下降(P<0.01)；L6H4治疗后，FT和DT组心肌AdipoR1蛋白的表达升高，但仍低于NC组(P<0.01)，与Western blot法检测心肌AdipoR1蛋白表达的结果相符，见图3、4。

Figure 2.The morphological changes of the myocardial tissues of the rats with different treatments (Masson staining, ×100). Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;△△P<0.01vsDM.

图2大鼠心肌的Masson染色观察

Figure 3.The expression of AdipoR1 and TGF-β1 in the rat myocardium with different treatments detected by immunohistochemistry (×400). Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;△△P<0.01vsDM.

图3免疫组化比较各组大鼠心肌AdipoR1和TGF-β1蛋白的表达

Figure 4.The expression levels of AdipoR1 in the rat myocar-dium with different treatments determined by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;△△P<0.01vsDM.

图4Western blot检测各组大鼠心肌内AdipoR1蛋白的表达

免疫组化发现TGF-β1在5组心肌细胞胞浆内均有表达，NC组大鼠心肌细胞的胞浆内及周围有少量散在的淡黄色物质，呈弱阳性表达；与NC组相比，TGF-β1蛋白在HF组中表达强度增高(P<0.01)，在DM组心肌细胞及间质细胞中呈强阳性表达(P<0.01)。经L6H4干预后，FT和DT组TGF-β1蛋白含量明显下降(P<0.01)。相关性分析表明，大鼠心肌AdipoR1的表达与血清APN水平呈正相关关系(r=0.734，P<0.01)，与TGF-β1表达水平呈负相关关系(r=-0.760，P<0.01)。

6透射电镜观察心肌变化

心肌细胞超微结构显示，NC组的大鼠心肌粗细肌丝排列整齐，闰盘结构清晰，肌节完整；肌丝间见成行排列的线粒体，呈椭圆形，结构清晰，线粒体嵴排列整齐、较密集。HF组大鼠心肌纤维排列尚整齐，粗细肌丝间隙略增宽，肌节结构尚完整；线粒体略肿胀，线粒体嵴稍紊乱。L6H4干预后，FT组上述病变减轻。DM组大鼠心肌超微结构损伤明显，心肌纤维排列紊乱，粗细肌丝间隙增宽，部分肌丝扭曲变形，甚至溶解消失，闰盘结构模糊，肌节结构不清；线粒体肿胀明显，线粒体嵴紊乱，部分消失；另见部分区大量胶原纤维沉积，提示心肌组织纤维化。DT组大鼠心肌纤维结构及线粒体形态较DM组明显减轻，见图5。

Figure 5.Ultrastructure of the rat myocardium in each group observed under transmission electron microscope (×10 000).

图5大鼠心肌的透射电镜观察

讨论

DCM是一种以心力衰竭为主要表现且与冠心病和瓣膜疾病无关的特异性糖尿病相关性心脏疾病，流行病学调查结果显示患有糖尿病患者死于心血管系统疾病的人数是非糖尿病患者死于心血管系统疾病的2～3倍[4]。近年来研究者逐渐认识到在DCM的发展进程中心肌纤维化起着重要的作用[5]。

TGF-β1是重要的纤维化细胞因子，一旦失调，能够增强心肌胶原基因的表达和心肌成纤维细胞的转化[6]，最终致使心肌细胞外基质过度累积，从而引起心肌纤维化，与心室的结构重建密切相关。Dasu等[7]研究表明，高血糖环境下可激活NF-κB，刺激TGF-β1的大量表达。Aragno等[8]发现氧化应激通过增加NF-κB进入细胞核使得TGF-β1转录增多，致心肌纤维化。Ma等[9]报道IL-6可经TGF-β1/Smad3途径诱导CFs中胶原蛋白的合成，促进心肌纤维化。此外，研究表明，高脂血症对心肌存在一定程度的损害，本实验Masson染色发现HF和DM组大鼠心肌间及血管周围胶原纤维含量明显增加,透射电镜发现心肌胶原蛋白沉积；免疫组化结果显示HF和DM组大鼠心肌细胞及间质TGF-β1的表达均显著高于正常对照组。综上所诉，证实TGF-β1在心肌纤维化中起了促进作用。

APN主要由脂肪细胞分泌，其受体AdipoR1，主要分布于骨骼肌、心肌等部位，两者结合具有抗炎、抗动脉粥样硬化及改善糖尿病症状等作用。Yan等[10]通过病例对照研究，发现患有心肌病的患者血清脂联素水平明显低于对照组，证实脂联素与心肌纤维化具有相关关系。本实验血清APN水平、心肌AdipiR1的表达与心肌TGF-β1的表达水平均呈负相关，可能通过多个途径抑制TGF-β1。有体外心肌细胞培养实验表明， APN可明显增加高糖环境下的心肌细胞活性，并通过下调TGF-β1/Smads通路信号转导，抑制TGF-β1的表达[11]。APN可以抑制NF-κB的激活，葡萄糖摄取，增加对胰岛素的敏感性[12]。APN还能抑制氧化应激及IL-6，进一步减弱TGF-β1致纤维化的危害。本实验相关性分析表明血清APN水平与FBG、血脂水平、FINS及HOMA-IR均呈负相关关系，进一步证实了APN对DCM的防治作用。

近些年，大量研究显示姜黄素不仅具有抗氧化、抗炎、清除自由基以及对心血管系统等广泛的药理作用, L6H4为姜黄素类似物，比姜黄素具有更高的稳定性。Asai等[13]研究推断姜黄素可能通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体，增强APN启动子活性，促进其分泌。胰岛素抵抗时，炎症因子IL-6、TNF-α等通过抑制APN启动子活性降低APN在脂肪细胞的表达，是APN的重要调控因素。有研究[14]显示姜黄素能抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，从而减弱IL-6和TNF-α对APN启动子活性的抑制。Bharti等[15]用姜黄素处理细胞后能有效抑制NF-κB活化，从而抑制TGF-β1转录，这个过程可能没有APN参与。L6H4治疗下FT组及DT组的血糖、血脂下降，同时伴有胰岛素抵抗改善。心肌纤维化是多种因素共同作用的结果，L6H4通过增加APN水平抑制TGF-β1这一途径是目前糖尿病心肌病防治的新思路。

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[2]王玲，徐梦菲，刘曦，等. 姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用[ J] . 中国病理生理杂志, 2014, 30(2):328-332.

[3]陈国荣，毛孙忠，杨开颜，等．糖尿病大鼠心肌病理变化及脂质过氧化作用和一氧化氮的改变[J]．临床与实验病理学杂志，2001，17(2):146-148．

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[10]Yan CJ, Li SM, Xiao Q, et al. Influence of serum adiponectin level and SNP +45 polymorphism of adiponectin gene on myocardial fibrosis[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2013, 14(8):721-728．

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[15]Bharti AC, Takada Y, Aggarwal BB. Curcumin (diferuloylmethane) inhibits receptor activator of NF-κB ligand-induced NF-κB activation in osteoclast precursors and suppresses osteoclastogenesis[J]. J Immunol, 2004, 172(10):5940-5947.

(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Effects of curcumin analogue L6H4 on myocardial tissue of type 2 diabetic rats

YING Li-li1, NI Jin-yao1, LI Hui-min1, YU Xia1, CHEN Lin1, CHEN San-mei2, CHEN Guo-rong1

(1DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325015,China;2SchoolofMedicalSciences,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:csm498@163.com；chengr1978@aliyun.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effects of curcumin analogue L6H4 on the myocardial tissue of type 2 diabetic rats and its mechanism. METHODS: Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control (NC) group, high-fat (HF) group, high-fat treatment (FT) group, diabetes mellitus (DM) group and diabetes treatment (DT) group.The rats in the latter 4 groups were fed high-fat diet for 4 weeks, then the rats in DM groups and DT groups were intraperitoneally injected with streptozotocin (STZ) to induce type 2 diabetes, while the rats in FT group and DT group were given L6H4. The blood glucose and lipid levels were detected by biochemical method, and serum adiponectin (APN) levels were detected by ELISA. The serum insulin levels were measured by radioimmunoassay and homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) were calculated. The morphological changes of myocardium were observed by Masson staining and electron microscopy. The protein expression of adiponectin receptor 1 (AdipoR1) and transforming growth factor β1(TGF-β1) in myocardial tissue were determined by immunohistochemistry. The protein expression of adipoR1 was also detected by Western blot for verification. RESULTS: Compared with NC group, the blood glucose, lipids, insulin, HOMA-IR and TGF-β1 were increased in HF and DM group, but they were decreased after treated with L6H4. Compared with NC group, the concentration of serum APN were decreased and the expression of AdipoR1 in the myocardium were weakened in HF group and DM group, and they increased after treated with L6H4. The myocardial fibrosis was obvious in HF group and DM group, the mitochondria in cardiomyocytes expanded, and the cristae disordered, partial disappeared. These lesions were significantly reduced after L6H4 treatment. CONCLUSION: L6H4 exerts a protective effect on the heart in type 2 diabetic rats. The increased concentration of serum APN, the enhanced expression of AdipoR1, and the expression of TGF-β1 inhibited by APN may be involved in the mechanism of protection．

[KEY WORDS]Diabetes mellitus; Myocardium; Curcumin analogue L6H4; Adiponectin; Adiponectin receptor 1; Transforming growth factor β1

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0027- 06

[收稿日期]2015- 08- 04[修回日期] 2015- 10- 14

*[基金项目]浙江省公益性技术应用研究计划(No.2011C23123)；温州市高层次人才创新技术项目

通讯作者△陈三妹 Tel: 0575-88345685; E-mail: csm498@163.com； 陈国荣 Tel: 0577-55579795; E-mail: chengr1978@aliyun.com

[中图分类号]R587.1; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.005