假地枫皮根皮提取液对神经细胞生长的影响

赵　氚，何　玲

·论著·

假地枫皮根皮提取液对神经细胞生长的影响

赵氚，何玲

[摘要]目的评价八角属植物假地枫皮的根皮提取液对神经细胞生长的影响。方法采用经神经竽长因子诱导的PC12细胞，以神经生长因子为阳性对照, 在无血清和有血清培养条件下分别对存活细胞进行MTT染色测定；以未分化的PC12 为效应细胞，采用图象分析法显微观测分化细胞的百分率。结果假地枫皮根皮提取液对经神经生长因子诱导的PC12细胞的增殖以及未分化PC12细胞凸起的生长均有促进作用。结论初步确认假地枫皮根皮提取液可能有促进神经增殖和生长的作用。

[关键词]假地枫皮；PC12细胞；增殖；分化

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种对神经细胞生长发育、分化、新陈代谢等方面具有重要调控作用的活性多肽[1]。NGF作为一种靶源性神经营养因子维持着特定神经元的存活和发育，它能促进发育中的感觉神经元及交感神经元的存活和分化，营养成熟的神经元，维持其正常的生物学功能，在神经系统损伤后起修复、营养作用。然而NGF的某些蛋白质性质(如化学性质不稳定，半衰期短，药代动力学特性欠佳，且不易通过血脑屏障等)限制了其成为理想的临床用药。此外，NGF可以与其低亲和力 p75NTR受体相互作用引起神经元死亡，这或许也是影响其临床应用的因素之一。因此，寻找小分子NGF类似物成为药物研发的热点之一[2]。近年来国内外对八角属植物进行了更为广泛的药理活性研究，相关研究结果表明利用PC12细胞模型，八角属植物红茴香根皮(IlliciumangustisepalumA.C.Smith)中的化学成分可能对PC12细胞有促进生长的作用[3]。本研究选用PC12细胞作为体外培养的实验模型进行观察，并采用MTT法和图像分析法考察另一种八角属植物假地枫皮根皮提取液对PC12细胞增殖、分化的影响，期望得到结论，并希望今后能为从八角属植物根皮中纯化其活性成分、探讨其化学性质提供一些参考[4]。

1材料与方法

1.1材料PC12细胞由中国药科大学新药筛选中心提供、保存；注射用鼠NGF购自武汉海特生物制药股份有限公司；假地枫皮根皮提取液由浙江泰康药业集团有限公司提供；新生小牛血清购自PAA Laboratories GmbH；DMEM粉末购自Invitrogen Corporation；MTT购自Amresco公司。

1.2方法(1)MTT方法：参照文献[3]。取对数生长期的经NGF诱导分化的PC12，复苏、扩增培养，调整细胞浓度为1×105，接种于96孔板，5% CO2、37℃分别在无血清培养条件下或有血清正常培养条件下培养箱中培养。将细胞分成：假地枫皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、以及假地枫皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与阳性药NGF(300 μg/L)联合用药组、阳性对照组、阴性对照组。阳性对照组给予NGF，NGF用磷酸盐缓冲液配制成4 000 μmol/L的母液浓度备用，给药时15 μl/孔/200 μl，终浓度为300 μg/L。阴性对照组给予与阳性对照等体积的磷酸盐缓冲液15 μl/孔/200 μl。各组各剂量采用3批细胞，重复3个孔。培养48 h后，加入MTT，5% CO2、37℃培养箱中继续孵育4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μl，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测定570 nm处的光吸收(OD570nm)。(2)图像分析法：参照文献[3]。将未分化的PC12细胞复苏、扩增培养，胰酶消化制成细胞悬液，用DMEM细胞培养液调节细胞密度5×103接种于96孔板继续培养。24 h后，将培养细胞分成：假地枫皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、以及假地枫皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与阳性药NGF(50 μg/L)联合用药组、阳性对照组、阴性对照组。每组设5孔细胞，每孔随机观测20个细胞，共100个细胞。24、48、72 h进行光镜观察，计数突起生长细胞(≥2倍细胞直径)占总细胞的百分率。增殖率(%)=(给药组OD值-阴性对照组OD值)/阴性对照组OD值×100%。

2结果

在有血清的正常培养条件下，假地枫皮根皮提取液中剂量和高剂量组均对PC12细胞有明显促增殖作用，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。受试药各剂量组未见细胞毒性，与NGF(300 μg/L)联合应用时，对促进PC12细胞增殖未见明显协同增效作用。见表1。

表1假地枫皮根皮提取液在有血清培养条件下对

NGF分化的PC12细胞的增殖作用

注：与阴性对照组相比aP<0.05

在无血清的培养条件下，假地枫皮根皮提取液各剂量组均对PC12细胞有明显促增殖作用，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。受试药各剂量组未见细胞毒性，与NGF(300 ng/ml)联合应用时，对促进PC12细胞增殖未见协同增效作用。见表2。

表2　假地枫皮根皮提取液在无血清培养条件下

注：与阴性对照组相比aP<0.05

与阴性对照组相比，假地枫皮根皮提取液各剂量组均能显著促进PC12细胞突起生长，第2天(48 h)诱导分化活性最强，第3天分化细胞百分数递减，并且呈剂量相关性。受试药各剂量组与NGF(50 μg/L)联合应用时，对促进PC12细胞突起生长有明显的协同增效作用。见表3。

3讨论

本研究结果分析表明, 假地枫皮根皮提取液具有显著促进PC12细胞分化的作用，且与NGF有明显的协同增效作用。假地枫皮根皮提取液在受试剂量对PC12细胞没有细胞毒性，均能显著促进PC12细胞增殖。在无血清培养条件下(缺营养损伤时)的

表3假地枫皮根皮提取液对PC12细胞的

促神经分化作用(每孔20个细胞)

促增殖作用强于在有血清正常培养条件下的作用。与NGF联合应用时，对促进PC12细胞增殖未见协同增效作用。这从细胞水平为中药促神经生长的机制提供了佐证。在实验中,尽管获得假地枫皮根皮提取液具有明显促PC12细胞生长的数据, 但这方面的研究还是相当初步的, 药物的体内过程, 与机体相互作用之后, 再作用于神经细胞的效应如何, 尚有待进一步的探索。此外，真正具有临床应用前景的神经营养因子类似物,应主要作用于神经系统或对免疫、内分泌等系统无明显的负面影响[5]。因此，利用PC12 细胞突起生长为指标进行假地枫皮根皮提取液促神经分化作用的确定,体外作用是肯定的但作用机制是不确定的,只能作为一种很实用的初级模型。假地枫皮根皮提取液目标活性的确定需通过作用机制的选择筛选以及体内试验完成。

[参考文献]

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[2]殷红，杜冠华. 促神经细胞分化小分子活性物质的筛选研究[J]. 中国药理学通报, 2005, 21(2):174-177. DOI:10.3321/j.issn:1001-1978.2005.02.012.

[3]赵氚，张沂，何玲，等. 红茴香根皮提取液对神经细胞生长和增殖作用的影响[J]. 海军医学杂志, 2013, 34(6):361-364. DOI:10.3969/j.issn.1009-0754.2013.06.001.

[4]龙碧波. 红茴香注射液局部注射治疗软组织损伤[J]. 海南医学, 2000, 11(2):58. DOI:10.3969/j.issn.1003-6350.2000.02.054.

[5]王丽梅，陈哲宇，路长林，等. PACAP促PC12细胞突起生长的分子机制[J]. 国外医学分子生物学分册, 2001, 23(6):353-357. DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2001.06.012.

(本文编辑：张阵阵)

Effect of Illicium jadifengpi B.N.Chang root bark extract on the enhancement of nerve growth

Zhao Chuan，He Ling

(NavyGeneralHospital,Beijing100048,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effect of Illicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract on the enhancement of nerve growth.Methods By using NGF as the positive control, the survival rate of the NGF-induced PC12 cells was detected with MTT staining under the culture conditions without or with serum. At the same time, by using the proliferated PC12 as reactive cells, the proliferating rate of PC12 cells was observed with the image analysis method under microscopy.ResultsIllicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract could produce good effects on the proliferation of the NGF-induced PC12 cells and the growth of the undifferentiated PC12 cells.ConclusionIt was preliminarily identified that Illicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract might contain a neurotrophic factor-like substance, which could enhance the proliferation and growth of nerve cells.

[Key words]Illicium jadifengpi B.N.Chang; PC12 cell; Proliferation; Differentiation

[作者单位]100048北京，海军总医院(赵氚)；中国药科大学药理教研室(何玲)

[中图分类号]R283.3

[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.011

(收稿日期：2016-01-23)