CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥GGB基因突变体的鉴定

雷建峰，徐新霞，李　月，代培红，刘　超，刘晓东*

(1新疆农业大学 农学院，新疆农业大学农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐830052；2新疆巴州农业技术推广中心，新疆库尔勒841000)

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥GGB基因突变体的鉴定

雷建峰1，徐新霞2，李月1，代培红1，刘超1，刘晓东1*

(1新疆农业大学 农学院，新疆农业大学农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐830052；2新疆巴州农业技术推广中心，新疆库尔勒841000)

摘要:GGB是抗旱负调控基因。为了获得拟南芥ggb突变体材料，构建了以拟南芥U6启动子驱动GGB sgRNA的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。将构建好的编辑载体利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。对转基因后代GGB基因的测序结果分析发现，在靶位点处有缺失4个碱基和增加1个T碱基的2种突变体产生。分别对野生型拟南芥和上述2种ggb突变体进行半定量RT-PCR分析结果显示，突变体材料中几乎检测不到GGB基因表达，说明获得了GGB基因敲除突变体。对野生型和ggb突变体叶片失水率、耐旱表型及单株种子量的测定结果表明，与野生型相比，拟南芥GGB基因突变后，叶片失水率显著减少，抗旱性明显增强，而单株种子量却并没有改变。研究表明，GGB是一种理想的作物分子育种的候选靶基因，获得的突变体为今后从农作物中克隆的GGB同源基因进行功能互补验证提供了有用的遗传材料。

关键词:拟南芥；CRISPR/Cas9；GGB；基因敲除；失水率

蛋白异戊二烯化修饰是蛋白质翻译后修饰的一种形式，具体是指把15个碳的法呢基或20个碳的香叶酰基共价连接到蛋白质碳末端最后4个氨基酸CaaX的半胱氨酸上，其中C是半胱氨酸，a常常是脂肪族氨基酸，而X通常是甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或半胱氨酸[1]。目前已知有3种蛋白酶复合体参与了蛋白异戊二烯化的修饰：蛋白法呢基转移酶、Ⅰ型蛋白香叶酰基转移酶和Ⅱ型蛋白香叶酰基转移酶。蛋白法呢基转移酶和Ⅰ型蛋白香叶酰基转移酶都是由α和β两个亚基组成，两者共用同一个α亚基，但β亚基不同。在拟南芥中蛋白法呢基转移酶的β亚基是ERA1，而Ⅰ型蛋白香叶酰基转移酶的β亚基是GGB[1]。研究发现ERA1对底物蛋白的碳末端最后4个氨基酸CaaX缺乏偏好性，而GGB几乎只异戊二烯化修饰最后一位是亮氨酸的蛋白质，即碳末端最后4个氨基酸是CaaL的蛋白质，尤其是对于碳末端为CaIL的蛋白质的修饰活性最高[2]。研究发现蛋白异戊二烯化修饰与抗旱反应存在非常紧密的关系，拟南芥era1突变体抗旱性明显增强[3-4]。然而era1突变体出现部分花败育，而且开花时间会推迟[5]。与era1突变体相比，拟南芥ggb突变体仅在气孔关闭上对ABA更加敏感，当拟南芥受到干旱胁迫时，GGB基因突变后，促使植株气孔关闭，抗旱性明显增强。最重要的是，ggb突变体在生长发育上与野生型相比没有明显差异[1]，表明它可能特异性地修饰活化了ABA信号通路中的一个关键负调控因子，进而负调控了ABA在气孔关闭中的功能。

生物信息学分析显示在水稻、玉米、棉花、番茄、马铃薯、葡萄等作物中均有1个拷贝的、与拟南芥GGB高度同源的基因。这些同源基因是否具有与拟南芥GGB同样的功能，能否可以作为作物抗旱育种的一种理想靶标基因？这需要进一步确认这些基因的功能，而最快捷可靠的证据来自于这些同源基因是否能功能互补拟南芥ggb突变体的表型。然而由于拟南芥ggb突变体研究报道时间较久，相关突变体的种子已丧失萌发能力，因此只能通过其他途径来获取。

基因组编辑技术是新出现的一种研究基因功能的重要技术工具，它可以高效产生特定基因功能失活突变体，能为生物体功能基因组学研究提供优质的遗传材料。目前它包括3种技术体系：锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)、TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)，以及2013年兴起的CRISPR/Cas9技术系统[6]。这些人工核酸酶都可以在基因组DNA特定位点上产生双链断裂，最后通过非同源末端连接或同源重组两种DNA修复途径来实现对双链DNA断裂点的修复。在自然状态下，同源重组修复是一种完全修复方式，而非同源末端连接修复则是一种不完全修复方式，修复完成后其双链DNA断裂处的碱基会发生缺失或增加或改变，从而导致基因组序列的定点编辑[7]。ZFNs和TALENs这两项技术在实施操作过程中技术难度较大、构建组装时间较长、花费较高[8]。近年来，逐渐被最新的CRISPR/Cas9基因组编辑技术所取代。CRISPR/Cas9系统原本是细菌在长期进化过程中形成的一种适应性免疫系统[9-10]。2013年，CRISPR/Cas9系统被改造成一种新的基因组定点编辑技术[11-12]。首先在基因组DNA上选择需要改造的基因靶位点，设计构建一段带有靶序列的sgDNA，然后与Cas9基因一起通过表达载体转入受体细胞。在转录出的sgRNA的引导下，通过碱基互补配对，将Cas9蛋白靶向结合到基因组DNA的对应位置上，Cas9切割目标DNA序列产生双链断裂，而断裂的DNA被非同源末端连接方式修复后最终实现对基因组靶目标位点的编辑。该技术操作相对简单，制作成本低。目前已经在多种植物物种(如番茄、烟草、水稻、小麦和玉米等)中成功地敲除目标基因[6,13-14]。本研究将利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，定点敲除GGB基因，获得新的拟南芥ggb突变体，并测试其抗旱性和种子产量，为验证其他作物GGB同源基因的功能提供互补转基因的受体材料。

1材料和方法

1.1实验材料

AtU6-26::sgRNA载体[15]、GV3101农杆菌感受态细胞、植物表达载体p1300均为新疆农业大学农业生物技术重点实验室保存，拟南芥Cas9表达载体[15]由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所惠赠。引物合成及测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.2方法

1.2.1sgRNA表达载体构建基于AtGGB(At2g39550)基因组序列，查找Cas9潜在靶向位点，根据靶位点的位置和GC含量设计sgRNA(表1)。靶序列通过退火：95 ℃每5 s降低0.5 ℃至20 ℃，插入到经BbsⅠ酶切的AtU6-26::sgRNA载体相应的位置上，T4连接酶连接过夜，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取单克隆测序鉴定带有GGB靶序列的sgRNA表达载体。

表1　本研究中使用的引物序列

注： 下划线为EcoRⅠ酶切位点

Note：Underlined sequences areEcoRⅠ restriction enzyme site

图1　sgRNA和Cas9共表达载体Fig. 1　Construction of sgRNA and Cas9 expression vector

1.2.2农杆菌转化载体构建采用酶切连接的方式构建sgRNA和Cas9共表达载体，用KpnⅠ和HindⅢ双酶切AtU6-26::sgRNA表达载体，回收AtU6-26::sgRNA片段(600 bp)，连接同样经KpnⅠ和HindⅢ酶切的Cas9表达载体，转化Trans1-T1感受态细胞，酶切鉴定的质粒命名为AtU6::sgRNA-Cas9(图1)。然后将sgRNA和Cas9共表达载体构建在植物表达载体p1300上，用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切AtU6::sgRNA-Cas9质粒，回收目标片段(5.9 kb)，连接同样经KpnⅠ和EcoRⅠ酶切的植物表达载体p1300质粒。转化Trans1-T1感受态细胞，候选的阳性克隆经酶切鉴定正确后，取10 μL AtU6::sgRNA-Cas9-p1300质粒转入农杆菌感受态GV3101，28 ℃倒置培养2 d，挑取阳性克隆于LB培养基(含50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif)培养至对数生长期，用于下一步侵染。

1.2.3拟南芥遗传转化将构建好的带有AtGGB靶序列的AtU6::sgRNA-Cas9-p1300农杆菌冻存液10 μL接种于LB培养基(含50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif)中活化。28 ℃，180 r/min震荡培养20 h左右。然后按1∶100体积比将活化菌液接种到15 mL LB培养基中，于28 ℃，180 r/min震荡培养，摇至菌液的OD600≈1.8～2.0时，4 000×g离心10 min收集菌体，弃之上清液，重悬于新鲜配制的转化液(1/2 MS液体培养基含5%蔗糖，0.02% Silwet L-77)，至终浓度OD600≈0.6～0.8。采用浸花法[16]转化拟南芥Col-0，待种子成熟后收获T1代种子，干燥7 d。将T1代种子消毒处理，播种在含有30 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS培养基上，4 ℃放置72 h，然后25 ℃(16 h光培养，8 h暗培养)筛选阳性苗，并统计阳性苗植株数量。

1.2.4拟南芥ggb突变体检测以转基因拟南芥基因组DNA为模板，利用 Primer 5.0软件设计拟南芥ggb突变位点检测引物(表1)。PCR扩增AtGGB基因，以野生型拟南芥为对照。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环后于72 ℃延伸10 min，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。对野生型和突变体PCR产物进行EcoRⅠ酶切鉴定，37 ℃ 3 h，对没有消化的PCR产物进行回收，连接到平端载体B-Zero(Transgen)上，挑单克隆测序，测序结果与AtGGB基因的参考序列进行序列比对分析。最后，统计ggb突变体在所有转化子中的突变频率。

1.2.5AtGGB基因表达RT-PCR检测按照ZolPlant RNA(Transgen)提取试剂盒操作步骤提取苗龄为20 d的野生型与突变体植株叶片的RNA，然后用反转录试剂盒(TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，Transgen)合成cDNA。以cDNA为模板，Actin2基因为内参对照。采用EasyTaq酶(Transgen)扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27个循环；72 ℃延伸10 min。按照调整内参基因的模板量，进行AtGGB基因靶位点目标片段的扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。最后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。所有引物见表1。

1.2.6拟南芥离体叶片失水率测定采用称重法[17]比较野生型拟南芥和ggb突变体植株离体叶片相对含水量差异，剪取苗龄为30 d的野生型拟南芥和ggb突变体植株地上部，分别用称量纸进行称重。每隔1 h称量其鲜重测定其失水率，设置3个重复。叶片失水率(%)=(原始质量某-时间点失水后质量)/原始质量×100%。数据整理与分析采用Excel 2013软件；采用DPS v7.05软件的LSD最小显著差数法进行差异显著性检验。

1.2.7抗旱表型鉴定及单株种子量测定将苗龄为20 d的野生型和ggb突变体植株进行干旱以及干旱后复水处理，拍照记录处理前后表型差异，并统计植株存活率。另外未处理的同批长势一致的野生型和突变体植株种子成熟后，采用称重法测定单株种子量，设置3个重复，探究突变体种子量是否与野生型种子量存在差异。

2结果与分析

2.1AtGGB突变位点选择

在拟南芥AtGGB基因组序列536 bp 处一个PAM(the protospacer-adjacent motif)位点前，设计了2条长为24 bp、带有EcoRⅠ酶切位点的靶序列DNA(GATTGTCTCTGCAGGAGAATTCTA和AAACTAGAATTCTCCTGCAGAGAC)，该靶序列经退火复性插入到经BbsⅠ酶切的AtU6-26::sgRNA载体上(图2)。

2.2CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

将构建好的带有GGB基因靶序列的AtU6::sgRNA-Cas9的重组基因片段(5.9 kb)连入植物表达载体p1300，经酶切鉴定，酶切结果与预期酶切片段大小相符，表明靶向敲除拟南芥GGB基因的CRISPR/Cas9基因组编辑载体已构建成功(图3)。

2.3Atggb突变体检测

用30 μg·mL-1潮霉素筛选T1种子，共筛选出45个T1代转基因株系。为了验证构建的CRISPR/Cas9基因编辑体系是否具有打靶效应，能否在预期设计的靶位点处产生DNA序列的编辑，对野生型和转基因T2代植株GGB基因靶序列进行了分析。结果显示野生型的PCR产物经EcoRⅠ酶切后会产生528 bp和208 bp两条带。而在转基因植株中如果靶序列突变发生在EcoRⅠ酶切位点处，就会导致EcoRⅠ酶切位点被破坏，从而EcoRⅠ无法识别和酶切目标位点，最终保留了736 bp 的原PCR目的条带(图4，A)。对没有被EcoRⅠ切断的PCR产物测序。测序结果表明：在靶位点处检测到2种能引起阅读框改变的突变体，一种为缺失4个碱基的突变，命名为GGB:-4；另一种是增加1个T碱基的突变,命名为GGB:+T(图4，B)。与其他类型突变体一起进行统计分析，结果发现发生序列改变的突变植株比例为84.4%(38/45)。

M. 1 kb DNA 标注图3　AtU6::sgRNA-Cas9-p1300基因编辑载体的酶切鉴定M. 1 kb DNA markerFig. 3　Identification of AtU6::sgRNA-Cas9-p1300 gene editing vector by restriction enzyme digestion

浅阴影序列表示拟南芥U6启动子；深阴影部分表示拟南芥GGB基因sgDNA序列；下划线表示GGB基因靶序列。图2　拟南芥U6启动子及GGB sgDNA序列The Arabidopsis U6 promoter is highlighted in light shadow；Dark shading indicates the sgDNA scaffold for GGB；GGB target sequence is underlinedFig. 2　The Arabidopsis U6 promoter and GGB sgDNA scaffold sequence

M.1 kb DNA； A. 采用PCR/RE的方法检测突变体(1和2泳道分别为阳性对照野生型拟南芥PCR酶切后产物和PCR酶切前产物电泳图；3泳道为ggb突变体PCR扩增产物；4～10泳道分别为ggb突变体PCR酶切后产物)；B. 第一行为野生型拟南芥GGB基因序列，蓝色序列表示带有EcoRⅠ酶切位点的靶序列，红色序列表示PAM位点(NGG)，字母M表示突变体，碱基的插入用‘+’号表示，碱基的缺失用‘-’号表示；C. 野生型GGB测序峰图；D. 突变体GGB;-4测序峰图；E. 突变体GGB，+T测序峰图图4　拟南芥ggb突变体检测M:1 kb DNA Maker；A. PCR/RE assays were performed to detect mutations(Lanes 1 and 2 represent undigested and digested PCR product of wild-type Arabidopsis respectively； Lanes 3 represent PCR amplification product of the ggb mutant； Lanes 4-10 represent digested PCR products of the ggb mutations)； B. The wild-type GGB sequence is given at the above, the target sequences with EcoRⅠrestriction site highlighted in blue and the PAM (NGG) highlighted in red. M represents mutation, ‘+’ represents insertion bases, ‘-’represents deletion bases； C. The Sanger sequencing result for wild-type GGB； D. The Sanger sequencing result for GGB：-4； E. The Sanger sequencing result for GGB：+TFig. 4　Detection of Arabidopsis ggb mutants

2.4AtGGB基因表达量检测

为了进一步检测突变体中AtGGB基因在转录水平上的表达变化，采用半定量RT-PCR方法分析了野生型与突变体植株中AtGGB的表达水平。结果(表5)显示，野生型材料中GGB基因表达水平较高，而2种突变体材料中几乎检测不到GGB的表达。

2.5Atggb突变体失水率测定

干旱是导致植物可利用水分亏缺的主要因素，而失水率是植株是否耐旱的重要生理指标[18]。前人研究结果表明拟南芥ggb基因T-DNA插入纯合突变体离体叶片失水率显著低于野生型拟南芥[1]。本研究测定了新ggb突变体植株离体失水率，结果显示，与拟南芥ggb基因T-DNA插入纯合突变体的表型相似，ggb突变体失水率也显著低于野生型拟南芥(图6)。

2.6Atggb突变体耐旱性表型鉴定

干旱处理前，野生型拟南芥和ggb突变体植株生长发育基本一致，这与前人[1]研究结果相同。干旱处理23 d后，野生型植株开始发生萎蔫，突变体植株并没有发生萎蔫。随着缺水时间的延长，野生型植株逐渐干枯死亡，而突变体植株表型相对较轻。干旱处理28 d后进行土壤复水，植株存活率测定结果显示，野生型材料由于失水过度而死亡，突变体材料复水后大多数能正常生长，GGB:-4突变体存活率为86.67%，GGB:+T突变体为51.11%(图7)，表型上与同批处理的野生型材料差异显著(图8)。

图5　AtGGB基因表达量分析Fig. 5　Expression analysis of GGB in Arabidopsis

图6　拟南芥叶片失水率测定Fig. 6　The water loss rate of Arabidopsis leaves

不同小写字母表示不同处理存在显著差异(P < 0.05)图7　复水后存活率测定Fig. 7　Determination of survival rate after rehydrationDifferent letters indicate significance differences among different treatments for the same parameter (P< 0.05)

图9　拟南芥单株种子量测定Fig. 9　Determination of seed weight per plant in Arabidopsis

2.7Atggb突变体单株种子量测定

单株种子产量是评价植株生产能力的重要指标。过表达的正调控基因通常会引起基因沉默或者因为异位表达而导致产量减少[19-20]。ggb抗旱性明显增强，虽然生长发育没有受到影响，但并不代表种子产量没有变化。通过测定成熟后ggb突变体与野生型拟南芥单株种子量，结果显示，ggb突变体植株单株种子量与野生型并没有明显差异，收获的种子量基本一致。说明拟南芥GGB基因突变后，其种子产量并没有受到抑制(图9)。

3讨论

干旱是限制植物生长的首要非生物胁迫因素，传统的育种手段很难解决这个问题。采用转基因方法，过量表达抗逆正调控基因是目前最经济有效，也是最普遍使用的抗逆育种途径。然而在实践过程中却出现了许多问题。首先超表达的基因，由于共抑制现象，常常导致基因沉默，相关性状不能长期稳定遗传[19]；其次由于这些基因异位超表达，经常使作物正常的生长发育受到抑制，导致产量减少[20]。即使使用诱导型启动子来驱动抗逆基因的表达，但基因沉默导致的遗传稳定性问题还依然存在。最重要的是它们所培育出的新品种都带有转基因成分，其所带来的生物安全性问题极大地限制了作物新品种的市场推广和应用。

A.干旱处理前；B.干旱处理后；C.复水后图8　干旱处理前后拟南芥的表型观察A. Before the drought treatment；B. After the drought treatment；C. RehydrationFig. 8　Observation phenotype of Arabidopsis before and after drought stress treatments

在植物体内除了目前普遍使用的抗逆正调控基因外，还存在一些负调控基因，这些基因突变，功能丧失后，植物的抗旱性也大大增强，如ERA1[3]、ABH1[21]、SAD1[22]、GGB[1]和DST[23]等，其中ERA1和GGB是参与蛋白质异戊二烯化修饰的两个重要基因。这种共价修饰促进了蛋白质与膜以及蛋白与蛋白之间的互作[24]。研究发现era1的突变体在气孔关闭上对ABA更加敏感，其抗旱性明显增强[3-4]。此外在油菜和小麦上ERA1的突变都表现出良好的抗旱性[25-26]。另外在豌豆[27-28]和番茄[24,29]中也鉴定出上述3种参与了蛋白异戊二烯化的蛋白复合体。这表明蛋白异戊二烯化修饰可能在植物中高度保守。与era1突变体相比，ggb突变体抗旱性也明显增强，但在生长发育上与野生型相比并没有明显差异[1]，因此GGB可能是作物抗逆分子育种的一种理想基因靶标。

为了方便快捷地验证棉花、番茄、马铃薯、葡萄、水稻、玉米等作物中与拟南芥GGB高度同源基因的功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，进行了靶向敲除拟南芥GGB基因的研究。结果显示，在45株转基因阳性植株中，出现GGB基因序列改变的有38株，T1代的突变效率高达84.8%，显示出该基因编辑技术的高效性。从38株T1代中筛选获得了2种有效的GGB基因敲除突变体，一种缺失4个碱基，另一种是增加1个T碱基，其结果都是产生基因移码突变，最终导致功能完全丧失。功能缺失的基因，其mRNA的转录或稳定性会存在严重缺陷，导致mRNA水平极低。对新获得的ggb突变体进行的半定量RT-PCR检测结果表明，突变体材料中也几乎检测不到GGB基因的表达，结果表明新获得的拟南芥突变体是GGB基因敲除突变体。进一步的失水率和抗旱性的测定也与GGB基因T-DNA插入突变体的检测结果一致。GGB作为一个抗旱负调控基因要想用于农作物分子育种，就要求它的后代相关性状能稳定遗传，生长发育不会受到抑制，产量不减少。拟南芥ggb突变体植株单株种子量测定结果显示，ggb突变体生长发育基本与野生型一致，收获的种子量也与野生型材料无显著差异。因此，GGB基因用于作物分子育种，可能也不会影响农作物的生长发育，导致产量减少。另外正如CRISPR/Cas9技术原理所述，利用该技术系统可以方便地获得任何靶基因突变的植物材料，然后通过仅仅一代杂交或自交就可以快速把转基因成分与突变靶基因分离开，从而获得无转基因成分的突变新材料，而且突变基因及其相应性状也能够像突变体一样稳定遗传[30]。

综上所述，本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得拟南芥ggb突变体，进一步验证了GGB可能是一种理想的作物分子育种的靶基因，为分析其它作物GGB同源基因的功能提供了理想的互补转基因受体材料。

参考文献:

[1]JOHNSON C D,CHARY S N,CHERNOFF E A,etal. Protein geranylgeranyltransferase I is involved in specific aspects of abscisic acid and auxin signaling inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2005,139(2): 722-733.

[2]ANDREWS M,HUIZINGA D H,CROWELL D N. The CaaX specificities ofArabidopsisprotein prenyltransferases explain era1 and ggb phenotypes[J].BMCPlantBiology,2010,10(1): 1-11.

[3]PEI Z M, GHASSEMIAN M, KWAK C M,etal. Role of farnesyltransferase in ABA regulation of guard cell anion channels and plant water loss[J].Science, 1998,282(5 387): 287-290.

[4]CUTLER S, GHASSEMIAN M. A protein farnesyl transferase involved in ABA signal transduction inArabidopsis[J].ScienceMagazine, 1996,273(5 279): 1 239-1 241.

[5]YALOVSKY S, KULUKIAN A, Young C A,etal. Functional requirement of plant farnesyltransferase during development inArabidopsis[J].ThePlantCell, 2000,12(8): 1 267-1 278.

[6]CHEN K,GAO C. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements[J].PantCellReports, 2014,33(4): 575-583.

[7]ZHOU H, LIU B, WEEKS D P,etal. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J].NucleicAcidsResearch, 2015,42(17): 10 903-10 914.

[8]SHAN Q, WANG Y, LI J,etal. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system[J].NatureProtocols, 2014,9(10): 2 395-2 410.

[9]BHAYA D, DAVISON M, BARRANGOU R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation[J].AnnualReviewGenetics, 2011,45(1): 273-297.

[10]WIEDENHEFT B, STERNBERG S H, DOUDNA J A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J].Nature, 2012,482(7 385): 331-338.

[11]CONG L, RAN F A, COX D,etal. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science, 2013,339(6 121): 819-823.

[12]MALI P, YANG L H, ESVELT K M,etal. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science, 2013,339(6 121): 823-826.

[13]LIANG Z, ZHANG K, CHEN K,etal. Targeted Mutagenesis inZeamays using TALENs and the CRISPR/Cas System[J].JournalofGeneticsandGenomics, 2014,41(2): 63-68.

[14]CHRISTOPHER B, VLADIMIR N, ZACHARY B,etal. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-Associated9 system[J].PlantPhysiology, 2014,166(3): 1 292-1 297.

[15]FENG Z Y, ZHANG B, DING W,etal. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J].CellResearch, 2013,23(10): 1 229-1 232.

[16]CLOUGH S J, BENT A F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].PlantJournal, 1998,16(6): 735-743.

[17]ZHOU S, HU W, DENG X,etal. Overexpression of the wheat aquaporin gene, TaAQP7, enhances drought tolerance in transgenic tobacco[J].PloSOne, 2012,7(12): e52 439.

[18]YUE Y, ZHANG M, ZHANG J,etal. Overexpression of the AtLOS5 gene increased abscisic acid level and drought tolerance in transgenic cotton[J].JournalofExperimentalBotany, 2012,63(10): 3 741-3 748.

[19]GELVIN S B. The introduction and expression of transgenes in plants[J].CurrentOpinioninBiotechnology, 1998,9(2): 227-232.

[20]YANG S J, VANDERBELD B, WAN J X,etal. Narrowing down the targets: towards successfulgenetic engineering ofdrought-tolerantcrops[J].MolecularPlant, 2010,3(3): 469-490.

[21]HUGOUVIEUX V, KWAK J M, SCHROEDER J I. An mRNA cap binding protein, ABH1, modulates early abscisic acid signal transduction inArabidopsis[J].Cell, 2001,106(4): 477-487.

[22]HUGOUVIEUX V, MURATA Y, YOUNG J J,etal. Localization, ion channel regulation, and genetic interactions during abscisic acid signaling of the nuclear mRNA cap-binding protein, ABH1[J].PlantPhysiology, 2002,130(3): 1 276-1 287.

[23]HUANG X Y, CHAO D Y, GAO J P,etal. A previously unknown zinc finger protein, DST, regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control[J].GenesandDevelopment, 2009,23(15): 1 805-1 817.

[24]CROWELL D N, HUIZINGA D H. Protein isoprenylation: thefatof the matter[J].TrendsinPlantScience, 2009,14(3): 163-170.

[25]WANG Y,YING J,KUZMA M,etal. Molecular tailoring of farnesylation forplantdrought tolerance and yield protection[J].ThePlantJournal,2005,43(3): 413-424.

[26]MANMATHAN H, SHANER D, SNELLING J,etal. Virus-induced gene silencing ofArabidopsisthalianagene homologues in wheat identifies genes conferring improved drought tolerance[J].JournalofExperimentalBotany, 2013,64(5): 1 381-1 392.

[27]QIAN D, ZHOU D, JU R,etal. Protein farnesyltransferase in plants: molecular characterization and involvement in cell cycle control[J].PlantCell, 1996,8(12): 2 381-2 394.

[28]YANG Z B, CRAMER C L, WATSON J C. Protein farnesyltransferase in plants-Molecular-cloning and expression of a homolog of the beta subunit from the garden pea[J].PlantPhysiology, 1993,101(2): 667-674.

[29]YALOVSKY S, LORAINE A E, GRUISSEM W. Specific prenylation of tomato Rab proteins by geranylgeranyl type-II transferase requires a conserved cysteine-cysteine motif[J].PlantPhysiology, 1996,110(4):1 349-1 359.

[30]FENG Z Y, MAO Y, XU N,etal. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns ofCRISPR/Cas-induced gene modifications inArabidopsis[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUnitedStatesofAmerica, 2014,111(12):4 632-4 637.

(编辑:宋亚珍)

Identification ofGGBMutant Caused by CRISPR/Cas9 inArabidopsis

LEI Jianfeng1, XU Xinxia2, LI Yue1, DAI Peihong1, LIU Chao1, LIU Xiaodong1*

(1 College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Laboratory of Agricultural Biotechnology of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052，China；2 Center of Bazhou Agricultural Technology Promotion, Korla, Xinjiang 841000，China)

Abstract:GGB is a negative regulator of drought resistance. In order to obtain the Arabidopsis ggb mutant, we used AtU6 promoter to drive the expression of AtGGB sgRNA and coresponding CRISPR/Cas9 genome edting vector was constructed and was transferred into Arabidopsis by Agrobacterium-mediated floral dip. After sequencing of GGB in T2 generation, two kinds of mutants with a deletion of 4 bases and an addition of 1 base (T) were found at the target site, respectively. Semi-quantitative RT-PCR analysis results showed that the expression of GGB gene was almost not detected in the ggb mutant, which indicated that the mutants were GGB knockout lines. Through measuring the water loss rate, drought resistant and seed yield per plant, ggb mutant exhibited decreased water loss rate, improved drought resistance, but unchanged seed yield per plant compared to wild-type. Taken together, the above results indicated that GGB is an ideal candidate target gene for crop molecular breeding and ggb mutant is useful for functional complemention of GGB homologous genes cloned from crops.

Key words:Arabidopsis; CRISPR/Cas9; GGB; gene knockout; water loss rate

文章编号:1000-4025(2016)05-0857-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0857

收稿日期:2016-01-17;修改稿收到日期:2016-04-18

基金项目:国家自然科学基金(31470289)；新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJGRI2015084)

作者简介:雷建峰(1989-)，男，在读硕士研究生，主要从事棉花分子生物学研究。E-mail：15299175640@163.com *通信作者:刘晓东，博士(后)，副教授，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：xiaodongliu75@aliyun.com

中图分类号:Q781;Q785;Q786

文献标志码:A