广藿香香叶醇合酶基因克隆及表达分析

欧阳蒲月,曾少华，莫小路*

(1 广东食品药品职业学院,广州 510520；2 中国科学院华南植物园,广州 510650)

广藿香香叶醇合酶基因克隆及表达分析

欧阳蒲月1,曾少华2，莫小路1*

(1 广东食品药品职业学院,广州 510520；2 中国科学院华南植物园,广州 510650)

摘要:香叶醇合酶(geraniol synthase，GES)是香叶醇形成过程中非常重要的酶，是萜类代谢途径的限速酶。根据课题组广藿香转录组数据中的GES 转录本序列设计基因全长扩增引物，采用RT-PCR方法克隆了广藿香GES基因的全长cDNA序列。对该基因进行了相关的生物信息学分析，并利用荧光实时定量PCR法检测了PcGES1基因在4个广藿香栽培种中不同时期茎、叶中的表达情况。结果显示：广藿香GES基因包含一个完整的ORF框，长1 734 bp，编码577个氨基酸，命名为PcGES1,GenBank登录号为KF926075 ；PcGES1基因编码的氨基酸序列与罗勒GES基因编码的氨基酸序列最为相近。广藿香GES蛋白定位在叶绿体中，无跨膜区域。PcGES1主要在叶中表达，老叶中表达量最高；从不同栽培种来看，PcGES1在石牌广藿香和高要广藿香中表达模式相似，在海南广藿香与印尼广藿香中表达相似，在海南广藿香老叶中表达最高。该研究结果为进一步阐明广藿香萜类代谢途径奠定了基础。

关键词:广藿香；香叶醇合酶；萜类合成

香叶醇合酶(geraniol synthase，GES)是香叶醇形成过程中非常重要的酶，是环烯醚萜类成分合成途径的限速酶。2007年，以色列科学家向西红柿中成功地导入了一种柠檬罗勒基因，该基因能够制造一种香叶醇合酶，从而使西红柿产生类似柠檬的芳香气味，花果香味的新型转基因西红柿诞生了。目前，香叶醇合酶基因的研究已经被越来越多的科学家们所关注[1]。香叶醇是大多数药用植物、香料植物产生香味的主要化学成分。前体物质geranyl diphosphate (GDP)在香叶醇合酶的作用下生成香叶醇的中间体，进而生成了香叶醇[1-2](图1)。目前，在唇形科罗勒属植物[3-4]、紫苏属植物[5]，樟科细毛樟[6]、夹竹桃科长春花[7]、败酱科缬草与马鞭草科甜舌草[8]中展开了香叶醇合酶的研究。

广藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth]为唇形科刺蕊草属植物，以全草入药[9]，是“藿香正气软胶囊”、“藿香正气丸(水)”、“保济丸”等中成药以及香料/化妆品等商品的主要原料。

广藿香的主要化学成分为挥发油，属萜类化合物[10-11]。广藿香作为一个自然分类群属于亚洲热带种，原产东南亚菲律宾、马来西亚等国。然自宋代从南洋传入中国岭南地区(今广东)后，经过长期人工栽培，在中国各地引种的广藿香形态上虽有一些变异，但干燥药材差别不明显，采用传统的形态组织学方法难以区分种内的分化类型，且各地广藿香含油量有所差异。广藿香目前存在4个栽培种：石牌广藿香、高要广藿香、海南广藿香和原产地的印尼广藿香。文献报道广藿香挥发油化学组成与产地分布、种植和采收季节有关；广藿香按其挥发油的成分可分为两种类型：即酮型广藿香(石牌广藿香与高要广藿香)和醇型广藿香(海南广藿香与原产地的印尼广藿香),并认为广藿香存在产地及挥发油成分不同的分化类型，是适应特定环境的结果，其本质上由遗传变异所决定[12]。

图1　香叶醇的形成过程[1-2]Fig. 1　Synthesis process of geraniol[1-2]

为探索广藿香各栽培品种间的遗传差异与其挥发油成分之间的关系，本实验基于广藿香的转录组数据分析，对广藿香萜类代谢途径中的香叶醇合酶进行基因克隆和表达分析研究。

1材料和方法

1.1材料

4个广霍香栽培种石牌广霍香、高要广霍香、海南广霍香和印尼广霍香种植于广东省中药研究所岭南中药园。选取海南广藿香[P.cablin(Blanco) Benth. cv.hainangensis]叶，迅速放入装有液氮的保温瓶中，后置于-75℃冰箱保存备用。本材料经广东省中药研究所蔡岳文老师鉴定。DH-5α感受态细胞由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1RNA提取取-75 ℃保存的叶，在180～200 ℃烘烤过的研钵中用液氮将其充分研磨，迅速倒入DEPC处理过的离心管中，待液氮挥发后，按100 mg材料1 mL 试剂的比例加入适量Trizol，下面的步骤按说明书(Tiangen DP421)进行。1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，并用紫外分光光度计(Nanodrop 2000c)测定总RNA浓度和纯度。

1.2.2cDNA合成初始反应体系：Oligo dT(20 pmol/μL，广州凯基生物有限公司)2 μL；RNA 10 μL；dNTPmix(25 μmol/L)2 μL；RNase-free ddH2O 12 μL。将反应体系于65 ℃变性5 min，取出后置于冰上1 min以上，向初始反应体系中加入下列试剂：5×first-strand buffer 8 μL；0.1 μmol/L DTT 4 μL；Superscript Ⅲ反转录酶(200 u/μL，Life公司)2 μL；H2O 2 μL。再将总反应体系于42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min,于PCR仪上进行第一链cDNA合成。反转录产物cDNA可在-20 ℃保存。

1.2.3基因克隆根据广藿香转录组中长为1 591 bp Unigene10850序列，利用ORF阅读框预测其含有一个完整的开放阅读框，并利用Primer3在线设计正向引物GES1-F(5’- AATTAAACTACCAAACAACATTA -3’)和 反向引物GES1-R(5’-AGTTTTTATGTACAAATCCACGCAT-3’)。PCR反应体系：3 μL第一链cDNA(反转录产物稀释10倍)为模板； 2.5 μL LA PCR buffer；2 μL正向及反向特异引物(10 mmol/L，上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；0.25 μL LATaqDNA聚合酶(日本宝生物有限公司)；用无菌去离子水将体系补至25 μL。PCR反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。结果检测：取PCR 产物5 μL，用1%琼脂糖电泳检测。将上述PCR产物割胶，使用凝胶回收试剂盒(日本宝生物有限公司)过柱回收。回收程序依据试剂盒说明书进行。各取4.5 μL回收产物，克隆到pMD19-T载体(日本宝生物有限公司)过夜连接。将连接产物转入DH-5α感受态细胞，经涂布培养，在氯苄抗性平板上进行阳性克隆筛选，各取4～8个进行菌液PCR验证，后各取2个阳性克隆进行双向测序(广州中美泰和生物技术有限公司)。

1.2.4序列的生物信息学分析先将所测得的序列在NCBI 数据库中进行Blast 搜索，初步确定这些基因的类别。使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)进行开放阅读框预测，再进行PcGES基因的一系列分析。其编码蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；PcGES蛋白质结构搜索分别采用在线工具ExPASy PROSITE (http://www.expasy.ch/prosite/)和美国国立生物技术信息中心(NCBI)在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。在线HMMOTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html)进行跨膜区预测；在线分析氨基酸序列/疏水性分析(http://web.expasy.org/protscale)；用HMMTOP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)检测跨膜结构；使用SignalP4.0Server进行分泌蛋白预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；利用WOLFPSORT (http://wolfpsort.org/) 进行蛋白定位信号预测，使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)进行蛋白保守结构域搜索。采用MEGA6.06软件内置的NJ法构建进化树。所有软件如无特殊说明，均采用默认参数。

1.2.5PcGES1基因表达分析取广藿香4个栽培种的嫩叶、成熟叶、老叶、嫩茎、成熟茎和老茎等组织，同上方法提取各组织总RNA 1 μg，使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara) 进行DNA消化和反转录得到cDNA 第一链，并且将cDNA 原液稀释10倍作为qPCR的模板。以actin(ACT)基因作为内参，参考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)说明书(日本宝生物有限公司)设计引物:PcACT基因上游引物5-GCTCCTAGCAGCATGAAGATCA-3，下游引物5-AGCATCAGCAGACAGCAATCAT-3；PcGES1基因上游引物5-GGAAGGATTTGAATGGGGAG-3，下游引物5-TGCTTGTACACCACTTGGGA-3。qPCR反应在罗氏lightcycle480定量PCR仪上完成。反应体系20 μL：SYBR premix Ex Taq Ⅱ(2x)10 μL, 正反引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，H2O 6.4 μL。qPCR 反应程序采用两步法：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，循环数40；反应结束后继续运行溶解曲线程序，以确保目的产物的特异扩增。以Actin作为内参，使用2ΔΔCt方法来确定基因相对表达量，其中参照物表达量定为“1”[13]，表达数据运用SigmaPlot10.0进行分析。

2结果与分析

2.1广藿香PcGES1基因的克隆

以海南广藿香总RNA为模板进行逆转录获得cDNA序列，利用RT-PCR扩增得到1条1 800 bp左右的条带，对于扩增所得条带进行回收、连接、转化、阳性克隆检测和测序后获得1条1 828 bp的正确序列，利用NCBI的ORF Finder预测该序列含有一个完整的开放总计框，长1 734 bp，编码577个氨基酸(图2)。将该基因命名为PcGES1，GenBank登录号为KF926075。

2.2PcGES1基因编码蛋白特性分析

PcGES1基因预测编码577个氨基酸，利用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam对其编码蛋白的理化性质进行预测分析。推测PcGES1的分子式为C3006H4727N791O868S24，分子量为66.61 kD，等电点为5.88；带负电残基(Asp+Glu)为79，正电残基(Arg+Lys)为73。该蛋白的不稳定系数为54.35，脂肪系数为95.01，亲水性系数为-0.257。在线SignalP4.0 Server 软件分析结果表明PcGES1为非分泌蛋白。WOLFPSORT预测表明PcGES1定位在叶绿体中(chlo: 12.0, cyto: 1.0)。用HMMTOP预测PcGES1无跨膜区域。应用protscale对PcGES1蛋白的氨基酸序列/疏水性预测分析结果表明，PcGES1多肽链第437位的亮氨酸具有最高的分值2.700，疏水性最强；第505位的谷氨酸具有最低的分值-2.833，亲水性最强。整个来看，其亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，为亲水蛋白。使用InterProScan进行蛋白保守结构域搜索，发现其主要有2个保守结构域，第63～260为一个结构域，这个区域为萜类环化酶/α-α环-异戊烯基转移酶蛋白域，也是萜类合酶， N末端区域；第249～574为另一个结构域，主要为类异戊二烯合酶域与萜类合酶金属结合域(图3)。

图2　PcGES1基因的全长cDNA及推衍的氨基酸序列Fig. 2　The full-length cDNA and deduced amino acid sequence of PcGES1

图3　利用InterProScan分析PcGES1蛋白的保守结构域Fig. 3　Analysis of PcGES1 conserved domains using InterProScan

2.3PcGES1编码蛋白的系统进化树分析

从GenBank蛋白质数据库搜索发现，目前，已公布的植物GES基因并不多。从NCBI非冗余蛋白数据库(Nr)中选取与PcGES1基因编码蛋白相似性较高的6条蛋白序列，采用MEGA6.06软件,用其内置NJ法构建进化树。结果(图4)表明，广藿香PcGES1基因编码的氨基酸序列与罗勒(Ocimumbasilicum，Q6USK1.1)GES编码的氨基酸序列聚在一起，再与油橄榄(Oleaeuropaea，AFS59975.1,AFI47926.1)、长春花(Catharanthusroseus,AFD64744.1)GES编码的氨基酸序列聚在一起。

S. 石牌广藿香； G. 高要广藿香； H. 海南广藿香； Y. 印尼广藿香 图5　PcGES1基因在广藿香4个栽培种中的时空表达量P. cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis； G. P. cablin (Blanco) Benth.cv. gaoyaoensis； H . P. cablin (Blanco) Benth. cv. hainangensis；Y.P. cablin (Blanco) BenthFig. 5　Spatiotemporal expression profile of PcGES1 in four P. cablin(Blanco) Benth cultivars

2.4PcGES1的表达分析

利用实时定量PCR方法对PcGES1进行基因分析。结果表明：PcGES1在广藿香的不同栽培种、同一栽培种不同部位或不同时期均存在差异表达(图5)。从不同栽培种来看，PcGES1在海南广藿香中表达量最高，在印尼广藿香中表达较高，在高要广藿香的表达较低，在石牌广藿香中的表达最低；从不同组织来看，PcGES1在叶中的表达量远远高于茎，茎的表达量非常低，基本不表达；从不同发育时期来看，PcGES1在老叶中的表达量最高，比成熟叶与嫩叶高很多。

3讨论

GES基因是萜类代谢中环烯醚萜苷类成分合成途径的限速酶，前体物质GDP在香叶醇合酶(GES基因)的作用下形成了香叶醇。香叶醇是大多数香料植物产生香味的主要化学成分。目前，GES基因表达研究涉及的植物很少，仅在细毛樟[6]中进行了较详细的研究，其结果表明，细毛樟具有3种不同化学型。通过对3种不同化学型细毛樟GES基因表达模式研究发现，不同化学型的基因表达也不同，导致香叶醇主成分CtGerS在香叶醇化学型叶片中有明显表达，而在其余2个化学型只有较低表达量，此结果将化学型主成分的不同与形成主成分的基因直接联系起来。本研究立足于实验室所建立的广藿香高通量转录组测序数据，从中克隆到的1条GES基因，其与罗勒的GES基因一致性最高。从实时定量PCR分析结果来看，PcGES1基因主要在叶中表达，且在高要广藿香、海南广藿香、印尼广藿香老叶中表达量最高，而在茎中的表达较低。对广藿香植株不同部位化学成分含量的分析结果表明，叶的挥发油含量最高[14-16]，因此，PcGES1表达可能与挥发油的合成有关。已有研究[17]表明，成熟广藿香植株的叶中PTS基因表达量明显高于茎和根,茎略高于根,但差异不显著,即在成熟广藿香植株中,广藿香醇合成酶在叶中活性最高，叶是萜类成分基因表达的主要部位。本研究中，PcGES1在海南广藿香、印尼广藿香中表达量均比较高，而在高要广藿香、石牌广藿香中的表达量均较低，显示了PcGES1的表达与广藿香的物种属性有关[18-19]。PcGES1在高要广藿香、石牌广藿香中表达量都不高，但有意思的是，PcGES1在石牌广藿香中表达量最高的部位是较成熟的叶片，与其它3个栽培种存在明显差异，PcGES1的这种表达差异可能是导致石牌广藿香与其它3个栽培种挥发油成分差异的原因之一。本研究结果为萜类化合物生物合成的分子机制探究提供了新思路。

图中分支上的数字表示bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度的百分比；标尺代表遗传距离；括号内编号为氨基酸登录号图4　PcGES1与其它植物GES编码氨基酸序列系统发育树The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replications; The scale bar represents genetic distance; The accession No. is given in bracketFig. 4　Phylogenetic tree of amino acid sequences of GES1 between P. cablin(Blanco) Benth. and other plants

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(编辑:宋亚珍)

Clone and Expression Analysis of Geraniol Synthase Gene

inPogostemoncablin

OUYANG Puyue1, ZENG Shaohua2, MO Xiaolu1*

(1 Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China; 2 South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

Abstract:Geraniol synthase (GES), which is very important to the biosynthesis of geraniol, is one of the key enzymes in terpenoids pathways. Based on the transcriptome analysis of P.cablin, one unique sequence encoding GES was discovered and the primers for PCR were designed from it, the full-length GES cDNA was cloned using RT-PCR strategy and its bioinformatics analysis has been done. Gene expression profile of PcGES1 in leaves and stems of different development stages of four cultivars was evaluated using quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The results showed that the gene GES in P.cablin, named as PcGES1, accession number KF926075 in GenBank, contains a 1 734bp open reading frame and encodes a predicted protein of 577 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that the amino acids encoded by GES1 of P. cablin were closest to that of Ocimum basilicum. PcGES protein was located in chloroplast, no transmembrane district. qRT-PCR analysis indicated that PcGES1 mainly expressed in leaves, and the highest expression was in old leaves. The expression pattern analysis of PcGES1 among four cultivars indicated that the expression pattern of P. cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis

was similar toP.cablin(Blanco) Benth. cv.gaoyaoensis, while that ofP.cablin(Blanco) Benth. cv.hainangensiswas similar toP.cablin(Blanco) Benth. This study provided a foundation for exploring the mechanism of terpenoid biosynthesis inP.cablinplants.

Key words:Pogostemon cablin; geraniol synthase; terpenoids synthesis

文章编号:1000-4025(2016)05-0896-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0896

收稿日期:2016-01-24;修改稿收到日期:2016-05-06

基金项目:广东省科技计划项目(2015A040404029)；广东食品药品职业学院自然科学研究项目(2015YZ007)

作者简介:欧阳蒲月(1978-)，女，硕士，副教授，研究方向：药用植物分子生物学。E-mail：ouyangpy@gdyzy.edu.cn *通信作者:莫小路，教授，研究方向：药用植物生物技术。E-mail：moxl@gdyzy.edu.cn

中图分类号:Q785；Q786

文献标志码:A