海绵内/共生稀有放线菌Dermacoccus sp. X4次级代谢产物分离纯化及结构解析

张艳凤，许勇，陈雷，胡俊，张学成，房伟，方泽民，肖亚中

1 安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 2306012 安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心，安徽 合肥 230039



海绵内/共生稀有放线菌Dermacoccus sp. X4次级代谢产物分离纯化及结构解析

张艳凤1,2，许勇1,2，陈雷1,2，胡俊1,2，张学成1,2，房伟1,2，方泽民1,2，肖亚中1,2

1 安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230601
2 安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心，安徽 合肥 230039

张艳凤, 许勇, 陈雷, 等. 海绵内/共生稀有放线菌Dermacoccus sp. X4次级代谢产物分离纯化及结构解析. 生物工程学报, 2016, 32(5): 599–609.

Zhang YF, Xu Y, Chen L, et al. Isolation, identification and structural characterization of secondary metabolites from amarine sponge-derived rare actinobacterium Dermacoccus sp. X4. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 599–609.

摘 要:从中国南海西沙群岛10 m深海水中采集得到一株未鉴定海绵样品，对其进行共附生微生物的分离，得到真菌及细菌共16株。通过分子生物学鉴定及菌株发酵液抑菌活性测定，发现其中一株稀有放线菌皮生球属菌株Dermacoccus sp. X4对金黄色葡萄球菌具有较好抑菌活性。大量发酵制备该菌株发酵液，通过硅胶分配层析、ODS反相层析、SephadexTMLH-20凝胶过滤层析及C18反相层析等分离方法对发酵液成分进行分离，并使用液相质谱连用、一维核磁及二维核磁分析对分离得到的单一化合物进行鉴定，确定二酮哌嗪类化合物1个，吲哚酸酯类化合物2个。本研究中吲哚酸酯类化合物为首次从微生物次级代谢产物中得到，为丰富海洋微生物药用资源作出贡献。

关键词:海绵共附生微生物，次级代谢产物，抑菌活性，分离纯化，结构解析

Received: September 10, 2015; Accepted: December 21, 2015

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2013AA092901), Scientific Research Foundation for Returned Scholars, Ministry of Education of China, the Introduction Project of Academic and Technology Leaders in Anhui University (No. 32030066), Innovative Research Team Program of 211 Project in Anhui University.

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2013AA092901)，教育部留学回国人员科研项目，安徽大学人才引进计划 (No. 32030066)，安徽大学211工程创新团队计划项目经费资助。

海洋占据地球70%以上的面积，是新型海洋天然产物来源的巨大宝库。自20世纪50年代Bergmann和Feeney首次从海绵Tethya crypta中获得新颖的核酸衍生物以来[1-2]，此后每年都有上百种结构新颖且具有良好活性的新化合物被报道[3]。

软体动物是海洋生物的重要成员，在海洋生态平衡中发挥功能。其中，海绵由于其固着生活方式，缺乏有效的物理性防御，在激烈的生存竞争中,主要通过积聚或分泌多种具有攻击性、甚至毒害性的次级代谢产物来维护种群的生存，是新型活性化合物的重要来源。目前，已经从各类海绵中分离获得多个具有显著生物活性 (包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等) 的化合物[4-19]。然而，海绵资源有限，对海绵资源的过量捕捞会破坏海洋的生态平衡。因此，来源于海洋软体生物如海绵的药源材料短缺已经成为限制海洋药物开发的瓶颈。

近年来，随着对微生物及其宿主关系研究的不断深入，人们发现，来源于海绵的某些活性物质实际上是由与其共附生的微生物产生的[5]，无疑为海洋药物药源问题的解决提供了思路，即可以通过对共附生微生物的发酵制备来解决海洋药物的药源问题。

海绵共附生微生物物种多样，具有广泛的代谢产物多样性[14-15]，是新型生物活性物质的重要源泉[16-20]。目前，已从其共附生微生物中发现了若干结构新颖、活性独特的次级代谢产物，如从海绵Ircinia sp.中分离得到一个二倍半萜硫酸胍盐sulfircin，它具有抗真菌病原体活性(MIC为25 μg/mL)，它还能促进神经肌肉传导,也是乙酞胆碱酷酶的抑制剂[21]，来自海绵Xestospongia testudinaria共附生真菌Aspergillus sp.的2个新的倍半萜二聚体类化合物disydonols A和C，对HepG-2和Caski癌细胞有细胞毒性[22]。

为了更多了解海绵共附生微生物及其代谢产物，前期我们从南海海域10 m深处采集若干海绵样品。本研究中，我们对1株未鉴定海绵进行了共附生微生物的分离鉴定，获得16株微生物菌株，并对得到1株具有抑菌活性的稀有放线菌——皮生球菌属菌株Dermacoccus sp. X4合成的活性化合物进行初步分离纯化及结构解析。

1　材料与方法

1.1材料

SephadexTMLH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences)；YMC·GEL ODS-A-HG 12 nm S-50 μm (YMC Co.Ltd)；色谱纯甲醇及乙腈 (Merck KGaA)；硅胶200–300目及硅胶H板 (青岛海洋化工有限公司)。其他试剂均为进口或国产分析纯级。

1.2仪器

旋转蒸发仪 (EYELAN-1100，Tokyo RikakikaiCo.LTD)；高效液相色谱仪 (AGILENT 1260)；液质联用质谱仪 (SATUKN2200)；核磁共振波谱仪 (DMX500，Bruker)。

1.3分离培养基

细菌使用伊莫逊氏培养基进行分离；放线菌分别使用高氏培养基、琼脂培养基、淀粉干酪素琼脂以及葡萄糖硝酸盐琼脂进行分离；真菌使用马丁培养基和察贝克氏琼脂进行分离[23]。

1.4海绵共附生微生物的分离

海绵样品处理：取20 g海绵样品，无菌海水冲洗表面后，用75%酒精漂洗4 min，然后再用无菌海水冲洗4次 (最后一次清洗用的水涂布于相应培养基上检查表面消毒效果)，表面消毒的样品在无菌条件下剪碎，加入50 mL无菌海水，经漩涡振荡器振荡1 min后，静置至澄清，取上清液备用。

吸取0.5 mL经预处理的样液于装有4.5 mL无菌海水的试管中，充分混匀，按照10–1−10–5的比例稀释，用微量移液器吸取100 μL经稀释后的样品溶液至装有各相应分离培养基的培养皿中，用涂棒均匀涂布，涂好的平板置于28 ℃培养箱进行培养。生长的菌落挑出后进一步分离纯化，并记录菌落培养特征与个体形态。

1.5海绵共附生微生物的初步鉴定

细菌和真菌基因组DNA分别使用细菌和真菌基因组提取试剂盒 (康为世纪生物科技有限公司) 提取。使用引物27F及1492R (表1) 扩增各细菌菌株的16S rRNA基因序列[24]；使用引物P1及P2 (表1) 扩增各真菌菌株的ITS序列[25]。获得的DNA序列使用NCBI中的Blast程序进行相似性比对，确定各菌株的种属归类。

1.6海绵共附生微生物的抑菌活性测定

表1　扩增菌株16S rRNA基因和ITS序列引物Table 1 The primers used to clone the 16S rRNA genes and ITS sequence of the strains

收集各菌株培养至稳定期的发酵液备用。将活化好的金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus subsp., ATCC25923T)、大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC25922T)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans，ATCC14116T) 及白假丝酵母菌 (Candida albicans，ATCC10231T) 等4株待测菌的1 mL菌液 (OD600=1) 与100 mL伊莫逊氏培养基或沙氏琼脂培养基 (麦芽糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，补充蒸馏水至1 L)混合均匀后制备待测琼脂平板，将牛津杯置于琼脂平板上，每板放置4个，分别加入100 μL无菌水 (阴性对照)、发酵上清原液、1/2浓度发酵原液、1/4浓度发酵原液，每种菌设置3个平行。细菌置于37 ℃培养24 h，真菌置于28 ℃培养48 h后，观察是否有抑菌圈出现并测量抑菌圈直径大小。

1.7Dermacoccus sp. X4的分子生物学及形态学鉴定

将菌株Dermacoccus sp. X4的16S rRNA基因序列在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/) 及模式菌比对软件EzTaxon-e (http:// www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对后，在GenBank上获取相关的16S rRNA基因序列，使用MEGA 5.0进行比对分析后，采用Kimura 2-parameter模型和临接法 (Neighbor-Joining)构建菌株Dermacoccus sp. X4的系统发育聚类图，进一步确定该菌株的分类地位。

挑取菌株Dermacoccus sp. X4的单菌落在MT固体培养基平板上划线，置于28 ℃条件下培养生长72 h后观察其菌落大小及形态。取对数期的菌体用磷钨酸染色后采用透射电镜 (FEI Tecnai G2 F20, FEI) 观察菌体大小及形状。

1.8Dermacoccus sp. X4次级代谢产物提取

菌株发酵上清制备：对Dermacoccus sp. X4的发酵培养基进行优化后，选用生长对数期菌液作为种子液 (OD600=2.1)，按照1%接种量接种至马丁培养基中 (400 mL培养基/1 L三角瓶)，28 ℃、120 r/min条件下培养至90 h，收集发酵液，8 000×g离心去除菌体，得到澄清发酵液。

次级代谢产物的提取：采用等体积乙酸乙酯对发酵液进行萃取，分离小分子脂溶性物质，等体积萃取3次，收集乙酸乙酯组分，将乙酸乙酯相蒸发浓缩去除有机溶剂，得到菌株发酵液粗浸膏。

1.9次级代谢产物的分离纯化

发酵液浸膏570 mg溶于适当溶剂中，与5 g干硅胶拌样，干法上样后，采用硅胶200−300目层析柱 (内径40 mm，长度400 mm) 进行分离。用石油醚溶剂进行装柱后，采用梯度洗脱，洗脱体系分别为：石油醚∶丙酮=10∶0；9∶1；8∶2；7∶3；6∶4；5∶5；二氯甲烷∶甲醇= 9∶1；7∶3；5∶5；0∶10，每个梯度洗脱400 mL，收集各洗脱馏分，每管收集10 mL，并进行薄层层析分析，根据层析情况合并相同组分，共得到17个组分。将质量较大的组分15、16及17进一步进行凝胶色谱分离 (内径22 mm，长度1 200 mm)，柱材料为SephadexTMLH-20，采用甲醇作洗脱液，洗脱3个柱体积 (400 mL)，收集各洗脱馏分，并进行薄层层析分析，根据层析情况合并相同组分，将质量较大的组分15-1、16-2及17-1过ODS离子交换色谱柱 (内径22 mm，长度400 mm)，采用甲醇∶水=3∶7；4∶6；1∶1；7∶3及10∶0作洗脱剂，收集各洗脱馏分，并进行薄层层析分析，根据层析情况合并相同组分，将质量较大的组分15-1-B、16-2-A及17-1-4利用高效液相色谱进行分离，采用C18半制备柱 (Pheno-menex Gemini 5uC18110A，250 mm×10.00 mm 5 micron)，210 nm波长下进行检测，分离得到化合物单体。

1.10化合物的结构解析

取0.5 mg 样品溶于0.5 mL色谱级甲醇中进行质谱分析；将各样品分别以0.5 mL CH3DO溶解，反复交换2次。最后以0.7 mL CH3DO将样品溶于核磁管，加入一滴氘代丙酮作为内标，在23 ℃下，利用1H-NMR、13C-NMR 等核磁技术对各样品进行结构分析。

2　结果与分析

2.1海绵共附生微生物的分离

基于16S rRNA及ITS编码基因的序列聚类分析表明 (表2)，共得到16个不同种微生物菌株，分布于枝孢属 (Cladosporium sp.)、丛赤壳属 (Nectria sp.)、踝节菌属 (Talaromyces sp.)、青霉菌属 (Penicillium sp.)、锁掷酵母属(Sporidiobolus sp.) 等真菌，考克氏菌属(Kocuria sp.)、皮生球菌属 (Dermacoccus sp.)等放线菌及类芽孢杆菌属 (Paenibacillus sp.)等细菌。

2.2分离菌株的抑菌活性

经过培养观察，分离菌株Dermacoccus sp.X4 (16S rRNA gene GenBank ID：KT944034)对金黄色葡萄球菌显示出抑菌活性，且抑菌活性随发酵液的浓度的增加而增强，菌株发酵液原液、倍比稀释至1/2及1/4的发酵液的抑菌圈直径分别为：25 mm、23 mm及19 mm (图1)。

表2　海绵分离菌株的16S rRNA基因和ITS序列鉴定Table 2 The identification of strains isolated from sponge based on 16S rRNA gene and ITS sequence

图1　Dermacoccus sp. X4对新型隐球菌 (A)、白假丝酵母菌 (B)、大肠杆菌 (C) 及金黄色葡萄球菌 (D)的抑制作用Fig. 1 The inhibitory effects of Dermacoccus sp. X4 fermentation broth on C. neoformans (A), C. albicans (B), E. coli (C), and S. aureus subsp. (D). NC: negative control; FL: fermentation liquor.

2.3Dermacoccus sp. X4的分子生物学及形态学鉴定

基于菌株Dermacoccus sp. X4的16S rRNA基因序列构建Neighbor-Joining系统发育聚类图(图2)，系统发育聚类图显示，该菌株与已经报道的模式菌株Dermacoccus nishinomyaensis DSM20448T亲缘关系最近，且与Dermacoccus属的其他几个种也具有很近的亲缘关系，因此确定该菌株归属于Dermacoccus sp.。

Dermacoccus sp. X4为不运动的放线菌，在28 ℃条件下，在马丁培养基上生长72 h后，菌落呈规则圆形，直径约为1 mm，淡黄色，表面光滑湿润，中部隆起，为表面有光泽的克隆。电镜观察菌体为椭圆形，直径约为0.5–1.5 μm(图3)。

图2　菌株Dermacoccus sp. X4的系统发育聚类图 (邻接法)Fig. 2 The Neighbor-Joining tree of strain Dermacoccus sp. X4.

图3　菌株Dermacoccus sp. X4的菌落 (A) 和菌体(B) 形态Fig. 3 The morphology of the clony (A) and the cell (B) of Dermacoccus sp. X4.

2.4Dermacoccus sp. X4次级代谢产物分离

通过大量摇瓶发酵，获得Dermacoccus sp. X4发酵液10 L，得到乙酸乙酯萃取浸膏570 mg。经过各分离技术的综合运用，最终获得6个单一化合物 (表3和图4)。

2.5Dermacoccus sp. X4次级代谢产物结构解析

化合物X4-15：

1H-NMR (600 MHz，MeOD) δ:8.10 (1H，d，J=7.44 Hz，4-H)，7.86 (1H，s，2-H)，7.38 (1H，d，J=7.80 Hz，7-H)，7.13 (2H，m，5-H，6-H)；

表3　单一化合物质量Table 3 The quantities of the purified compounds

图4　单一化合物HPLC及TLC分析图谱Fig. 4 The high performance liquid chromatography (HPLC) and thin layer chromatography (TLC) spectra of the purified compounds.

13C-NMR (150 MHz，MeOD) δ:138.17 (C-8)，132.53 (C-2)，127.88 (C-9)，123.19 (C-6)，122.26 (C-4)，121.91 (C-5)，112.63 (C-7)。该化合物为白色粉末，质谱显示该化合物的相对分子质量为149，表明其含有N元素，推测其分子式为C8H7NO2。

结合1H-NMR谱图，发现氢的出峰位置均在δ6.0–8.5 (一般苯环上的氢出峰位置) 左右，另外δ7.86处为一单峰，故判断该化合物的骨架为吲哚结构。由1H-1HCOSY图谱可知，H-4和H-5相关，H-5和H-6相关，H-6和H-7相关，再由HMBC谱图和HMQC谱图可知，H-4/C-4，H-4/C-6，H-4/C-8，H-2/C-2，H-2/C-8，H-2/C-9，H-7/C-7，H-7/C-9，H-7/C-5，H-5/C-5，H-5/C-7，H-5/C-9，H-6/C-6，H-6/C-8，H-6/C-4，可判断该化合物为吲哚结构。质谱信息表明该化合物的相对分子质量为149，故确定该化合物为3-hydroperoxy-1H-indole，将该化合物的核磁数据与文献[26]比较，确定该化合物结构如下：

化合物X4-16A：

1H-NMR (600 MHz，MeOD) δ:7.52 (1H，d，J=8.34 Hz，4-H)，7.31 (1H,d，J=7.74 Hz，7-H)，7.14 (1H，s，2-H)，7.06 (1H，m，6-H)，6.98 (1H，m，5-H)，3.69 (2H，s，10-H)，3.63 (1H，m，2´-H)，3.56 (2H，m，1´-H)，3.50 (2H，m，3´-H)；

13C-NMR (150 MHz，MeOD) δ:179.38 (C-11)，138.15 (C-8)，128.76 (C-9)，124.53 (C-2)，122.35 (C-6)，119.72 (C-5)，119.48 (C-4)，112.16 (C-7)，109.62 (C-3)，73.86 (C-2´)，64.40 (C-1´，3´)，32.45 (C-10)。

化合物为白色粉末，分子量256，推测其分子式为C13H14NO4。将该化合物的核磁数据与X-4-2-15B比较，发现低场信号基本一样，而是在高场位置增加了几组峰，故初步判断该化合物的骨架为一个吲哚结构。由1H-1HCOSY图谱可知，H-4和H-5相关，H-5和H-6相关，H-6 和H-7相关，再由HMBC谱图和HMQC谱图可知，H-4/C-4，H-4/C-3，H-4/C-6，H-4/C-8，H-4/C-9，H-4/C-5，H-4/C-7，H-7/C-7，H-7/C-9，H-7/C-5，H-2/C-2，H-2/C-10，H-2/C-3，H-2/C-8，H-2/C-9，H-6/C-6，H-6/C-4，H-6/C-7，H-5/C-5，H-5/C-7，H-5/C-9，判断该化合物为一个在3号位被取代的吲哚结构。进一步分析δ：3.0–4.0的高场区域，结合氢谱、碳谱以及DEPT135谱图可发现，该区域为1个叔碳，3个仲碳。由HMBC谱图和HMQC谱图可知，H-10/C-10，H-10/C-11，H-10/C-3，H-10/C-4，H-10/C-9，H-2´/C-2´，H-2´/C-1´，H-2´/C-3´，H-1´/C-1´，H-1´/C-2´，H-1´/C-10，H-3´/C-3´，H-3´/C-2´，从而判断被取代部分为一个甘油酯片段，将以上两个片段结构按HMBC给出相关性，结合HMQC、1H-1HCOSY图谱数据，确定该化合物为3-吲哚乙酸甘油酯，将该化合物的核磁数据与文献[27]比较，确定该化合物结构如下：

化合物X4-17-4：

1H-NMR (600 MHz，MeOD) δ:7.02 (2H，d，J=8.10 Hz，2´,6´-H)，7.02 (2H，d，J=8.16 Hz，3´，5´-H)，4.35 (1H，s，3-H)，4.03 (1H，m，8-H)，3.53 (1H，m，5-H)，3.31 (1H，m，5-H)，3.03 (2H，m，10-H)，2.07 (1H，m，7-H)，1.78 (2H，m，6-H)，1.20 (1H，m，7-H)；

13C-NMR (150 MHz，MeOD) δ:170.77 (C-1)，166.94 (C-4)，157.67 (C-4´)，132.12 (C-2´，6´)，127.61 (C-1´)，116.17 (C-3´，5´)，60.04 (C-8)，57.89 (C-3)，45.91 (C-5)，37.65 (C-10)，29.39 (C-7)，22.71 (C-6)。化合物为白色粉末，从质谱图上可以看出该化合物的相对分子质量为260；从碳谱上看，该化合物有14个碳原子，推测其分子式为C14H16N2O3。

由1H-NMR谱图中的δ:7.02 (2H，d，J=8.10 Hz)，7.02 (2H，d，J=8.16 Hz)，并通过1H-1HCOSY谱图知其相互耦合，判断该化合物存在一个1，4取代的苯环结构。另外，由13C-NMR谱图中的δ:170.77和δ:166.94可判断该化合物还存在2个羰基。由1H-1HCOSY图谱可知H-3 和H-10相关，H-8和H-7相关，H-5和H-6相关，H-6和H-7相关，再由HMBC谱图和HMQC谱图可知，H-2´，6´/C-2´，6´，H-2´，6´/C-10，H-2´，6´/C-3´，5´，H-2´，6´/C-4´，H-3´，5´/C-3´，5´，H-3´，5´/C-1´，H-3´，5´/C-4´，H-3/C-3，H-3/C-10，H-3/C-1´，H-3/C-4，H-8/C-8，H-8/C-7，H-8/C-1，H-5/C-5，H-5/C-6，H-5/C-7，H-，10/C-10，H-10/C-1´，H-10/C-3，H-10/C-4，H-7/C-7，H-7/C-6，H-7/C-5，H-7/C-8，H-7/C-1，H-6/C-6，H-6/C-7，H-6/C-5，H-6/C-8，综上，判断该化合物为3-(4-hydroxybenzyl) hexahydropyrrolo-[1,2-a]pyrazine-1,4-dione。将该化合物的核磁数据与文献[28]比较，确定该化合物结构如下：

3　讨论

对从中国南海西沙群岛10 m深海水中采集得到1株未鉴定海绵样品进行共附生微生物分离，得到1株对金黄色葡萄球菌等具有抑菌活性的菌株Dermacoccus sp. X4，对该菌株的次级代谢产物进行初步分离，得到了6个单一化合物，对其中3个化合物的结构进行了解析。结果表明，这3个化合物分别为：1) 3-hydroperoxy-1H-indole；2) 3-吲哚乙酸甘油酯；3) 3-(4-hydr-oxybenzyl) hexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione。其中化合物1) 和2)为首次从微生物代谢产物中分离鉴定。由于本次研究中获得的这3个化合物的纯品质量分别为2.0 mg、1.1 mg及14.6 mg，质量较小，所以未对纯品化合物的抗菌活性进行测定。但根据文献调研的结果，Golubev和Suvorov对化合物1) 及2) 进行了合成，发现其具有抗结核分支杆菌活性和促进植物生长活性，并且作用于中枢神经系统[26-27]，但是由于化学合成成本高且步骤繁琐，限制了其应用开发。对化合物3) 的研究，有诸多抗菌、抗肿瘤及免疫活性的报道[28-30]。该研究为这3种活性化合物的制备提供了新的技术途径，也进一步表明海洋微生物是获取活性化合物的重要资源。

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(本文责编 陈宏宇)

Isolation, identification and structural characterization of secondary metabolites from amarine sponge-derived rare actinobacterium Dermacoccus sp. X4

Yanfeng Zhang1,2, Yong Xu1,2, Lei Chen1,2, Jun Hu1,2, Xuecheng Zhang1,2, Wei Fang1,2, Zemin Fang1,2, and Yazhong Xiao1,2
1 School of Life Science, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China
2 Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230039, Anhui, China

Abstract:We isolated and identified the symbiotic and adnascent microorganisms from an unidentified sponge collected from 10-meter-deep seawater of the Paracel Islands in China. A total of 16 strains were obtained and identified. Through bacteriostatic activity assay, one of the strains, Dermacoccus sp. X4, was found to effectively inhibit the growth of Staphylococcus aureus. Subsequently, its secondary metabolites were purified by silica gel partition, octadecylsilane (ODS) reverse phase, SephadexTMLH-20 size exclusion, and C18 reverse phase chromatography. Using liquid chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance, three of the purified compounds were structurally characterized to be one 3-(4-hydroxybenzyl) hexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione and two indole acid glycerides. This is the first report about indole acid glyceride isolated from microbial secondary metabolites, enriching marine drug candidate resources.

Keywords:sponge associated microorganism, secondary metabolite, bacteriostatic activity, isolation and purification, structural characterization

Corresponding author:Yazhong Xiao. Tel: +86-551-63861861; E-mail: yzxiao@ahu.edu.cn