人类多效生长因子Pleiotrophin的原核表达

李 红，刘成倩，易建中

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106）



人类多效生长因子Pleiotrophin的原核表达

李 红，刘成倩，易建中*

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106）

摘 要：根据GenBank上公布的Ptn核苷酸序列设计1对引物，利用RT-PCR的方法扩增出人类Ptn基因，将其克隆到原核表达载体pET-30a上，得到重组质粒pET-30a-Ptn。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞并进行表达条件优化，经SDS-PAGE电泳及Western Blotting分析表明，融合蛋白在0.5 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导3 h表达量最高，其分子质量约24.9 kD，表达产物主要以包涵体形式存在，且表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。

关键词：Pleiotrophin；原核表达；条件优化

Pleiotrophin（PTN）最早是1989年Bohlen等［1］从成体牛脑中分离纯化出的一种可与肝素结合的蛋白质，称为多效生长因子。Ptn基因在牛、鼠、人和鸡之间高度保守［2］，是目前已知的所有生长因子中最保守的一种基因。Ptn基因的表达产物是一种具有分泌性和多效生长因子作用的蛋白，在细胞的生长、分化及发育过程中均起重要作用［3］。研究表明，PTN具有刺激细胞增殖及迁移、细胞转化、促进血管生成、促进神经细胞的转化/轴突生长、肿瘤的生长、炎症反应、创伤修复、胚胎发育和参与骨发育等功能［4-9］。多种因子或化学物质如：成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板源生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、激素、一氧化氮（NO）都可以调节PTN的表达。PTN表达也可被炎症中的巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及缺血损伤部位的其他细胞上调［5］。外源Ptn基因导入可使NIH3T3细胞、SW13细胞发生恶性转化。因此，PTN作为肿瘤治疗的潜在分子靶点日益受到关注［10-11］。

甲型H1N1流感在全球肆虐至今，人兽共患传染病的抗击和防治再次成为公众关注焦点。最早发现于牛脑的多效生长因子PTN虽然在动物中研究不多，但其基因的高度保守以及多功能性，启发畜牧业科研人员对其功能进行探讨。PTN在健康组织中很少表达，但在多种肿瘤组织及血清中表达量明显增高。本试验借助一个难得的实验模型人肝胚细胞瘤细胞系HePG2，利用RT-PCR技术，构建了表达人类PTN的原核载体，并对PTN重组蛋白的表达条件进行优化，以期为深入研究PTN蛋白的结构和功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌种、载体及主要试剂

人肝肿瘤细胞系HepG2、E.coli TOP10感受态细胞及表达菌株E.coli（BL21）均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室保存；质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；T4连接酶、rTaq DNA聚合酶、反转录酶、反转录酶抑制剂、KOD酶、DNA Marker、pMD18-T载体均由大连宝生物工程有限公司提供；限制性内切酶BamHI、HindIII购自NEB公司；蛋白质Marker和TRN-zol-A+总RNA提取试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2引物设计

根据GenBank上公布的Pleiotrophin基因的全长序列，由Primer 5.0软件设计出1对特异性引物，上游引物Pleiotrophin-F：5’-ATACGGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCA-3’（下划线处为BamHI酶切位点），下游引物Pleiotrophin-R：5’-AGTGCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGT-3’（下划线处为HindIII酶切位点），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3RT-PCR扩增

提取HePG2细胞系的总RNA。cDNA合成反应条件（10 μL）为：总RNA 4 μL，Pleiotrophin-R引物1 μL，dNTP 1 μL于PCR管中65℃5 min，冰上迅速冷却2 min，离心。5×Prime Script Buffer 2 μL，Prime script RTase 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，H2O 1 μL，42℃水浴1 h，立即放到冰上冷却。RT-PCR反应条件（50 μL）为94℃5 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃10 min。反应结束后，使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。回收PCR产物，根据pMD18-T载体说明书连接获得重组质粒pMD18-T-Ptn。

1.4Ptn基因原核表达载体的构建和鉴定

利用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对Ptn基因PCR产物和表达载体pET-30a进行双酶切，将纯化回收后的PCR产物与表达载体pET-30a连接，连接物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过菌落PCR筛选出含有目的基因的重组菌落，将其命名为pET-30a-Ptn，此菌经LB液体培养基培养12 h后送上海华大基因科技股份有限公司测序。

1.5PTN蛋白诱导表达

将测序正确的菌落pET-30a-Ptn抽提质粒，转化Transetta（BL21）感受态细胞，培养过夜，挑取单菌落，接种于3 mL含Kam的LB液体培养基中，37℃活化过夜后，1∶100稀释到含Kam的LB液体培养基中，37℃200 r/min振摇培养至对数生长期OD600为0.5—0.8，加入终物质的量浓度为0.5—1.0 mmol/L的IPTG，37℃200 r/min振摇诱导培养3—7 h后收集菌体，用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检测。

1.6稀有密码子及密码子适应指数CAI值分析

利用在线分析网站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html及在线分析CAI值网站http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis分别对扩增的Ptn基因稀有密码的个数及CAI值进行分析。

1.7重组蛋白可溶性分析

挑取阳性重组菌的单菌落，接种于3 mL含Kam的LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后1∶100稀释接种到100 mL含Kam的LB液体培养基中；37℃200 r/min振摇培养至对数生长期OD600为0.5—0.8，加入终物质的量浓度为0.5 mmol/L的IPTG，37℃200 r/min振摇诱导培养3 h后收集菌体，将菌体用15 mL PBS洗2次，然后用PBS悬浮细菌，经超声波裂解，12 000 r/min离心15 min，沉淀也用15 mL PBS溶解，分别取适量超声后上清和沉淀加5倍上样缓冲液，煮沸裂解5 min，用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检测。

2　结果与分析

2.1HepG2细胞Ptn基因PCR扩增

以提取的总RNA为模板进行反转录，以Pleiotrophin-F/Pleiotrophin-R为引物进行PCR扩增，得到大小为529 bp的片段（图1），与预期结果一致。

2.2重组原核表达载体的筛选与鉴定

pMD18-T-Ptn与原核表达载体pET-30a酶切连接后，挑取10个单菌落进行菌落PCR筛选。由图2可知，挑取的10个菌落有7个是阳性，3个是阴性。取阳性菌落进行测序，序列没有发生突变和移码。

图1　HepG2细胞Ptn基因扩增结果Fig.1 Amplification results of Ptn gene from HepG2 cells

图2　pET-30a-Ptn菌落PCR筛选结果Fig.2 PCR results of pET-30a-Ptn

2.3Ptn基因稀有密码子分析及CAI值分析

利用稀有密码子在线分析网站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html对Ptn基因进行分析，结果显示：序列内含有18个稀有密码子，18个稀有密码子于序列中分布比较均匀。通过在线分析软件（http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis）进一步对Ptn基因序列进行分析，密码子适应指数CAI（codon adaptation index）值为0.65，CG含量为51.83%（图3）。软件提示CAI值大于1.0或CG含量30%—70%则利于基因的高效表达，Ptn基因虽然CAI值小于1.0，但CG含量为51.83%且稀有密码子分布均匀，利于其蛋白的表达。

图3　Ptn基因CAI和GC含量分析Fig.3 Analysis of codon adaptation index（CAI）and GC content of Ptn gene

2.4重组菌诱导表达及重组蛋白可溶性分析

重组菌pET-30a-Ptn诱导后，经SDS-PAGE电泳分析，所得重组蛋白的分子质量约为24.9 kD（图4），与预期结果相同。IPTG为0.5 mmol/L和1.0 mmol/L对PTN蛋白质诱导没有太大差异。3 h、5 h和7 h分别诱导出目的蛋白，发现3 h表达量高一些。重组菌体pET-30a-Ptn超声裂解后，经SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白主要在超声后的沉淀中，表明此蛋白主要以包涵体形式存在。

2.5重组蛋白的Western Blotting分析

超声后的菌体沉淀经SDS-PAGE电泳，转PVDF膜后，在24.9 kD处出现目的条带（图5），结果表明重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。

图4　PTN重组蛋白表达的SDS-PAGE检测结果Fig.4 SDS-PAGE results of PTN recombination protein

图5　PTN重组蛋白Western Blotting分析结果Fig.5 Western Blotting results of PTN recombination protein

3　结论与讨论

大肠杆菌原核表达系统适合多种原核基因以及一些真核基因的表达。然而，外源蛋白的表达水平与多种因素有关。其中，密码子的使用频率差异是影响外源蛋白表达效率的因素之一。Ptn基因虽然含有18个稀有密码子，但由于稀有密码子分布比较均匀，没有连续出现，而对其表达影响不大。CAI值小于1.0时，不利于目的蛋白表达，但是目的基因GC含量在50%左右，则利于蛋白的表达。因此，目的蛋白要想成功表达，需考虑多个因素，可以借助生物信息学，通过实验验证，确立最佳表达条件。

本研究通过构建Ptn基因的原核表达载体pET-30a-Ptn，实现其在E.coli（BL21）中的高效表达，并对融合蛋白重组表达的主要因素进行了优化，确定了诱导表达的条件。诱导剂IPTG的用量、诱导温度和诱导时间等对PTN的表达量都有一定影响，融合蛋白在0.5 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导3 h表达量最高。由于重组蛋白含有多聚组氨酸，可以与Ni-NTA琼脂糖颗粒结合，因此可以利用Ni-NTA进行蛋白的亲和纯化。

PTN在胎儿分娩时表达达到高峰，之后，随着组织器官发育成熟而逐渐降低［4］。成人仅在脑、舌及子宫中可检测到［12］。但值得重视的是，PTN蛋白存在于多种肿瘤组织及血清中［13-14］。HepG2是一种分化好的人肝胚细胞瘤细胞系，保留了较完整的代谢酶及其活性［15］，为顺利克隆Ptn基因提供了素材。Ptn基因作为一个原癌基因，与肿瘤的发生发展关系紧密，其表达水平可以作为肿瘤诊断、治疗、预防评价的指标。Pleiotrophin基因在人、牛、鸡和鼠之间高度保守，是目前细胞因子中氨基酸序列保守程度最高的蛋白，为此从HepG2细胞系中克隆此细胞因子对研究家禽畜牧业中鸡肿瘤疾病有一定的启发和促进作用。

本研究根据Ptn的基因序列，通过RT-PCR技术，获得了HepG2细胞Ptn基因，并构建了Ptn基因的原核表达载体pET30a-his-Ptn，优化了其诱导条件，在大肠杆菌在实现了高效表达，成功纯化了重组PTN蛋白。

参 考 文 献

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（责任编辑：闫其涛）

Prokaryotic expression of human multieffect growth factor Pleiotrophin

LI Hong，LIU Cheng-qian，YI Jian-zhong*
（Institute of Animal Husbandry & Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：According to the relevant sequence from GenBank，the specific primers were designed for amplifying Ptn gene by RT-PCR method.The Ptn gene was cloned into prokaryotic expression vector to construct the recombinant expression plasmid pET-30a-Ptn.The fusion protein was expressed in E.coli（BL21）and the induction conditions for expression were optimized.The high yield of fusion protein was achieved with 0.5 mmol/L IPTG，37℃for 3 hours.The 24.9 kD expressed protein of PTN was identified by SDS-PAGE and Western Blotting.The protein existed mainly in the form of inclusion body and could react specificly with His-tag monoclonal antibody.

Key words：Pleiotrophin；Prokaryotic expression；Optimization

中图分类号：S85

文献标识码：A

文章编号：1000-3924（2016）03-067-05

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.14

收稿日期：2015-09-14

基金项目：上海市科技人才计划（14YF1414600）

作者简介：李红（1983—），女，博士，助理研究员，主要从事动物分子生物学和免疫学的研究。Tel：021-62204612，E-mail：lihong20061029 @163.com

*通信作者，Tel：021-62204612，E-mail：yijianzhong@yahoo.com